中文字幕一级黄色A级片|免费特级毛片。性欧美日本|偷拍亚洲欧美1级片|成人黄色中文小说网|A级片视频在线观看|老司机网址在线观看|免费一级无码激情黄所|欧美三级片区精品网站999|日韩av超碰日本青青草成人|一区二区亚洲AV婷婷

復旦大學藥學院

上海市食品藥品檢驗所

國家藥品監(jiān)督管理局化學藥品制劑質(zhì)量分析重點實驗室

本文主要針對基因毒性雜質(zhì)中的N-亞硝胺類化合物，介紹其毒理學研究進展以及食品、水體、煙草、藥品等不同基質(zhì)中檢測方法的研究進展，包括毒理學作用機制、前處理方法、定量方法等，旨在為藥品基質(zhì)中N-亞硝胺類化合物的檢測研究提供參考。

N-亞硝胺是一類以亞硝基—NO 的氮原子與氨基中的氮原子連接，并在氨基上發(fā)生取代而生成的一類化合物，在堿性溶液中穩(wěn)定。

其生成機制多樣，包括仲胺類化合物與亞硝酸之間的相互作用[1]，叔胺類化合物與一氯胺之間的親核取代反應(yīng)[2]，溶劑N,N-二甲基甲酰胺(DMF)的氧化[3]，橡膠硫化劑與空氣中氮氧化合物相互作用[4]等。

基因毒性雜質(zhì)是指能夠直接或間接損傷細胞DNA，產(chǎn)生致突變和致癌變的化合物，含有基因毒性雜質(zhì)警示結(jié)構(gòu)，毒性未經(jīng)證明的化合物稱為潛在基因毒性雜質(zhì)。

目前普遍認為基因毒性雜質(zhì)損傷DNA 的機制為造成染色體斷裂，DNA 重組，在DNA 復制過程中以共價鍵結(jié)合或插入。

鑒于基因毒性雜質(zhì)對人類健康的危害，歐盟發(fā)布了1 個超級化合物結(jié)構(gòu)，包含了目前所有的基因毒性雜質(zhì)警示基團，例如磺酸酯類、鹵代烷烴類、肼類和N-亞硝胺類等。

最近多個廠家生產(chǎn)的纈沙坦原料藥中檢出N-亞硝基二甲胺(NDMA)，引發(fā)制藥行業(yè)對N-亞硝胺類化合物的廣泛關(guān)注，本文主要對N-亞硝胺類化合物的毒性和檢測方法的研究進展做一綜述。

2017 年世界衛(wèi)生組織發(fā)布的致癌物清單中，多種N-亞硝胺類化合物位列一類、二類致癌物，包括常見的4-(甲基亞硝胺基)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮、N-亞硝基降煙堿、N-亞硝基二甲胺、N-亞硝基二乙胺、N-亞硝基甲基乙基胺、N-亞硝基二丙胺、N-亞硝基二丁胺、N-亞硝基嗎啉、N-亞硝基哌啶、N-亞硝基吡咯等。

FDA根據(jù)The Carcinogenic Potency Database(CPDB 數(shù)據(jù)庫)中的毒理學數(shù)據(jù)，通過換算，列出了可供參考的N-亞硝基二甲胺和N-亞硝基二乙胺的人體攝入限值，分別為0.096 μg·d^-1和0.0265 μg·d^-1。

但是大多數(shù)N-亞硝胺類化合物的毒性研究仍缺乏充分的人體實驗數(shù)據(jù)，所以在進行毒理學研究時常使用階段性毒理學閾值，按照長期接觸計算，每日允許攝入限值為1.5 μg。

此類化合物常出現(xiàn)在腌制類食品[7]、化妝品[8]、煙草[9]、水[10]、藥品[11-13]等物質(zhì)中，對人體健康具有極大的危害。

1.1 致癌機理

自20 世紀N-亞硝胺類化合物被發(fā)現(xiàn)以來[14]，關(guān)于此類化合物的毒性研究從未停止。

百年來陸續(xù)發(fā)現(xiàn)N-亞硝胺類化合物與多種癌癥的發(fā)病相關(guān)，并對其作用機制進行了進一步研究。

Gankhuyag 等[15]發(fā)現(xiàn)煙草中的N-亞硝胺類化合物與乳腺癌發(fā)病有因果關(guān)系，煙堿型乙酰膽堿受體(nicotine acetylcholine receptor, nAChR)是陽離子選擇性通道受體，其激活與細胞增殖、抗凋亡和血管生成過程有關(guān)，而nAChR 受體家族成員中α9nAChR 的表達在雌激素受體陽性的乳腺癌細胞中上調(diào)，與雌激素受體聯(lián)合刺激乳腺癌的發(fā)生。

且側(cè)流煙霧的毒性約是主流煙霧的4 倍，被動暴露也是不可忽視的高危因素。Hirata 等[16]采用醛脫氫酶(ALDH)免疫組化技術(shù)檢測4-(甲基亞硝胺基)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮對腺癌人類肺泡基底上皮細胞(A549 細胞)的影響，發(fā)現(xiàn)煙草中特有的4-(甲基亞硝胺基)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮，通過劑量依賴的方式增加醛脫氫酶陽性細胞的比例，誘導活性氧產(chǎn)生，而產(chǎn)生的活性氧激活了A549 細胞中的Wnt 信號通路，進一步誘發(fā)了肺癌。

而Kume等[17]發(fā)現(xiàn)大鼠膀胱癌中，N-丁基-N-(4-羥基丁基)亞硝胺誘導L 型氨基酸轉(zhuǎn)運體1(L-typeamino acid transporter 1, LAT1)高表達，有利于腫瘤血管的生成，加速腫瘤的生成和轉(zhuǎn)移。

1.2 DNA 損傷機理 

對N-亞硝胺類化合物與DNA 作用的進一步研究還發(fā)現(xiàn)，4-(甲基亞硝胺基)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮經(jīng)代謝活化后，會產(chǎn)生許多DNA 加合物，包括O²-甲基胸苷(O²-Me-dT)和O²-[4-(3-吡啶基)-4-氧代丁基-1-胸苷(O²-POB-dT)，體積較大的O²-POB-dT 具有較高的遺傳毒性，有26%的跨損傷合成發(fā)生，而O²-Me-dT 的遺傳毒性較小，但有55%的跨損傷合成發(fā)生。

2 種病變均引起細菌優(yōu)勢突變T→G 的頻率增高[18]。

同時Du 等[19]對N-亞硝胺引發(fā)的DNA 加合物進行研究也發(fā)現(xiàn)在雙鏈質(zhì)粒中，O²-POB-dT 和O⁴-POB-dT 加合物能中度阻斷DNA 復制，分別誘導T→A(14.9%)和T→C(35.2%)突變；另一方面，O⁶-POB-dG對DNA 復制有輕微抑制作用，主要引起G→A 轉(zhuǎn)變(75%)。

1.3 其他毒性機理

亞硝胺類化合物除了能夠致癌，造成DNA 突變，在其他方面也具有不同程度的毒性。

例如，N-亞硝基丁胺、N-亞硝基二乙胺、N-亞硝基二甲胺、N-亞硝基二苯胺等能增加大鼠體內(nèi)肌酸激酶和乳酸脫氫酶活性，增加自由基水平，降低抗氧化酶活性，從而增加心血管疾病的發(fā)生率[20]。

N-Sheweita 等[21]研究了環(huán)境中常見的4 種N-亞硝胺：N-亞硝基二甲胺、N-亞硝基二乙胺、N-亞硝基甲基乙基胺和N-亞硝基二苯胺，通過測定雄性家兔體內(nèi)17β-羥類固醇脫氫酶(17β-HSD)活性和組織病理學觀察，發(fā)現(xiàn)4 種N-亞硝胺均能抑制家兔肝臟和睪丸組織抗氧化酶活性，改變肝臟和睪丸組織結(jié)構(gòu)，導致肝毒性和不孕癥。

O-由此可見，N-亞硝胺類化合物對健康的危害不容忽視，對各個來源的N-亞硝胺類化合物進行檢測十分必要。

傳統(tǒng)的鹽酸萘乙二胺法和薄層色譜法操作簡便，對設(shè)備要求低，但靈敏度低，現(xiàn)在已經(jīng)難以滿足分析的需要，因此靈敏度更高的新型儀器逐漸取代了傳統(tǒng)的分析手段。

同時分析工作者們針對不同基質(zhì)中N-亞硝胺類化合物的檢測方法進行研究，開發(fā)出了不同的前處理方法，進一步提高了檢測靈敏度。

下面介紹不同基質(zhì)中N-亞硝胺類化合物檢測的最新研究進展。

2.1 食品中的檢測

食品中的N-亞硝胺類化合物來源主要是各類包裝材料生產(chǎn)過程中副產(chǎn)物和腌制發(fā)酵過程的副產(chǎn)物。

由于食品直接與人體接觸，潛在風險高，近些年陸續(xù)開發(fā)了多種N-亞硝胺類化合物測定方法。

Lu 等[25]通過2-(11H-苯[a]咔唑)乙基氯甲酸酯(BCEC-Cl)對目標化合物進行熒光標記，采用三氯甲烷-乙腈分散液液微萃取來富集標記后的目標化合物，以高效液相色譜法對泡菜、臘腸、咸鴨蛋等中式傳統(tǒng)腌制食品進行檢測，各種化合物定量限介于0.03~0.21 ng·g^-1之間，日內(nèi)精密度和日間精密度均符合要求。

該方法與熱能檢測法相比，靈敏度提高近100 倍，而且所需試劑量小，檢測儀器簡單，易推廣。

Kühne 等[26]則采用不同的溶劑對食品包裝材料進行模擬遷移實驗，包括去離子水、3%乙酸、10%乙醇和50%乙醇，利用液相色譜串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜對遷移樣品中的N-亞硝胺類化合物進行檢測，前處理方法簡便，依靠質(zhì)譜進行定量檢測，靈敏度高。

同時，Kühne等在實驗中也發(fā)現(xiàn)環(huán)境溫度為40 ℃時，N-亞硝基二苯胺在純水、3%醋酸、10%乙醇、50%乙醇4 種介質(zhì)中均易發(fā)生降解，6 h 內(nèi)含量下降明顯，這提示在后續(xù)的研究過程中要注意低溫保存N-亞硝基二苯胺。

Seo 等[27]采用液液萃取結(jié)合固相萃取的方式，以Extrelut NT 為液液萃取基質(zhì)，Sep-PakFlorisil 為固相萃取填料，以氣相色譜串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜(化學電離源)定量，對食品中的無脂類基質(zhì)和富脂類基質(zhì)中的N-亞硝胺類化合物進行檢測，線性、精密度、回收率較好，7種化合物定量下限范圍為0.3~0.58 μg·kg^-1；此研究首次針對不同基質(zhì)的特點開發(fā)不同前處理方法，可以實現(xiàn)多種同類型基質(zhì)樣品的同時檢測，在色譜柱的選擇上也采用了DB-5ms柱串接DB-WAX 柱，能夠更好地對化合物進行分離，方法具有通用性，應(yīng)用前景良好。

Zhao 等[24]創(chuàng)新性地采用了柱前熒光標記法檢測N-亞硝胺類化合物。樣品用二氯甲烷提取甲醇復溶后，N-亞硝胺化合物進行脫氨反應(yīng)，然后用1,2-苯并-3,4-二氫咔唑-9-氯甲酸乙酯(BCEOC)對目標N-亞硝胺化合物進行標記，再利用BCEOC 化合物中的大型共軛結(jié)構(gòu)，通過液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀進行檢測，N-亞硝基吡咯、N-亞硝基二乙胺、N-亞硝基二丙胺、N-亞硝基二丁胺4 種化合物線性相關(guān)系數(shù)大于0.999 8，檢測下限在1.3~2.5 ng·L^-1之間，精密度RSD 小于7%。

對食品樣本牛肉、咸鴨蛋、腌黃瓜等進行加樣回收試驗，回收率均達到90%~105%。該方法利用N-亞硝胺結(jié)構(gòu)上的叔胺N 進行檢測，改變了常見的檢測模式，為新型檢測方法的開發(fā)提供了思路。

2.2 水體中的檢測

煙草中的N-亞硝胺類化合物是在煙草調(diào)制、加工過程中，由煙草中的生物堿發(fā)生亞硝化反應(yīng)生成的，是煙草中特有的化合物，常見的有4-(甲基亞硝胺基)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮(NNK)、N-亞硝基降煙堿(NNN)、N-亞硝基新煙草堿(NAT)、N-亞硝基假木賊堿(NAB)4種。

Zhang等[34]采用了分散固相萃取的方式對煙草中的N-亞硝胺進行提取，分散固相萃取(DSPE)是一種快速、耐用、簡便、廉價、安全的前處理方法，向煙氣提取物中加入0.1%三甲胺水溶液并超聲處理30 min后，取1.5 mL溶液加載至DSPE小柱上，依靠渦旋和離心進行提取分離，無需復雜的樣品處理步驟。

采用高效液相色譜結(jié)合軌道離子肼質(zhì)譜儀進行檢測，通過對6個平行樣品的分析，驗證了該方法的有效性，平均回收率為84.7%~118%，RSD小于15%。

Chen等[35]采用二維液相色譜-串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜儀，對弗吉尼亞型卷煙煙氣中特有的中低濃度的N-亞硝胺類化合物進行了分析。

先用Cambridge纖維收集主流煙霧，并用0.1mol·L^-1乙酸銨溶液萃取，然后超聲30 min，用0.22 μm聚四氟乙烯濾頭過濾，作為供試品溶液。

供試品溶液進樣后首先采用強陽離子交換柱對煙氣中酸性和中性組分進行第一維分離，然后采用反相液相色譜-串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜儀，并以同位素氘代物為內(nèi)標，在多反應(yīng)監(jiān)測模式下，對卷煙主流煙氣中的N-亞硝胺類化合物進行了高靈敏的測定；

與傳統(tǒng)方法相比，該方法幾乎沒有基質(zhì)干擾，測得的亞硝胺含量在0.027~0.094 ng·mL^-1范圍內(nèi)，重現(xiàn)性好，準確度高；最后，將該方法應(yīng)用于肯塔基州香煙的分析，結(jié)果與煙草科學研究合作中心聯(lián)合試驗的結(jié)果一致。

Zhang等[36]自主設(shè)計了一種前處理方式，首先利用Cambridge濾板和聚四氟乙烯注射器過濾樣品，然后采用自主設(shè)計的全自動在線固相萃取技術(shù)對樣品進行前處理，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法定量，對NNN、NNK、NAT和NAB的定量下限分別達到每根香煙6.0、1.0、3.0和0.6 pg的水平，遠低于目前市售香煙中的最低水平，方法的準確度在92.8%~107.3%之間，日內(nèi)和日間的RSD分別小于5.4%和7.5%。

該方法具有靈敏度高，選擇性好，準確度高，自動化程度高，能夠批量處理等優(yōu)點。

2.4 藥品中的檢測

藥品中的N-亞硝胺類化合物的研究在20世紀70年代就已經(jīng)開展[11-13]，但是后續(xù)的研究進展緩慢，只有有少量的文獻報道。

Castegnaro等[37]對水蒸氣蒸餾進行了改進，在蒸餾體系中加入一定量的礦物油，以克服蒸餾過程中的起泡現(xiàn)象，并將此方法應(yīng)用于氨基比林、土霉素、雙硫侖中N-二甲基亞硝胺的檢測。

該方法以氣相色譜進行分離，以熱能檢測器進行定量，最低檢測限可低至1 μg·kg^-1，但該方法取樣量大，且操作過程煩瑣，提取效率較低。

Norwood等[38]采用氣相色譜-熱能檢測器定量分析吸入氣霧劑中揮發(fā)性N-亞硝胺。該方法從藥品包裝中提取目標分析物，并通過氣相色譜-熱能分析檢測進行分析。

樣品分析表明，在每罐1 ng的微量水平上，吸入氣霧劑未檢測出N-亞硝胺。

2018年7月纈沙坦原料藥中檢測出N-亞硝基二甲胺(NDMA)以及厄貝沙坦制劑中檢測出N-亞硝基二乙胺(NDEA)，氯沙坦鉀制劑中檢測出N-亞硝基-N-甲基-4-氨基丁酸(NMBA)為我們敲響了警鐘，開發(fā)高靈敏度的檢測方法和簡便高效的前處理方法迫在眉睫。

因此各國藥品監(jiān)管部門紛紛發(fā)布檢測方法，要求加強對N-亞硝胺類化合物的監(jiān)測，表1中列出中國、美國、歐盟藥監(jiān)部門推薦的檢測方法，并對前處理方法、定量方法、靈敏度水平進行了總結(jié)。

這些檢測方法僅是針對NDMA或NDEA進行檢測，N-亞硝基二丙胺等其他N-亞硝胺類化合物的檢測，還需要進一步開發(fā)更適合的方法。

中國食品藥品檢定研究院[39]的方法采用甲醇溶解樣品后直接進樣，但纈沙坦易溶于甲醇，大量不揮發(fā)性物質(zhì)進入質(zhì)譜系統(tǒng)，易污染離子源，造成背景噪音升高。

FDA直接進樣的方法則采用二氯甲烷作為提取溶劑，除溶解大量基質(zhì)外，二氯甲烷的強揮發(fā)性對準確定量也有一定的影響。

雖然相對食品、煙草，藥品中的基質(zhì)較為簡單，但大量基質(zhì)進入檢測系統(tǒng)，多次進樣后系統(tǒng)的穩(wěn)定性、靈敏度均會受到影響。

因此如何進行前處理，去除基質(zhì)干擾，是今后藥品中N-亞硝胺檢測今后研究的重點。

自纈沙坦中檢出N-亞硝基二甲胺后，N-亞硝胺類化合物的檢出范圍不斷擴大，今后制藥企業(yè)、藥品監(jiān)管部門對此類化合物的毒性研究和檢測方法研究勢必更加重視，但是沙坦類化合物中N-亞硝胺類物質(zhì)的檢測仍然存在一些難點。

首先，沙坦類化合物與N-亞硝胺類雜質(zhì)極性相近，且N-亞硝胺類雜質(zhì)的含量相對于沙坦類藥物來說屬于痕量雜質(zhì)，藥品中大量基質(zhì)的存在影響方法的穩(wěn)定性和準確度。

所以如何在前處理過程中除去大量的沙坦類藥物，而不損失或盡可能少損失N-亞硝胺類化合物是前處理過程中需要關(guān)注的重點。

雖然目前在食品、水、煙草領(lǐng)域，有很多新穎的前處理方法，如椰子殼活性炭固相萃取小柱萃取法[30]、熒光標記衍生化結(jié)合分散液液微萃取法[25]、分子印跡固相萃取小柱萃取法[33]，但是受化合物極性、取樣量等限制，這些處理方法無法在藥品體系中直接應(yīng)用。

因此原理簡單，操作簡便，回收率穩(wěn)定的前處理方法更適合于藥品體系。

其次N-亞硝胺類化合物是一系列含有相同官能團的化合物，因此如何保證檢測的專屬性則是定量環(huán)節(jié)需要優(yōu)先考慮的。

相比于單四極桿質(zhì)譜儀，選擇性更強的三重四極桿質(zhì)譜儀能夠提供更好的專屬性，避免假陽性的結(jié)果。

在此，由衷地期望本文為藥品中N-亞硝胺類基因毒性雜質(zhì)檢測提供參考，能有更深入的研究成果出現(xiàn)，能夠擴大檢測范圍，提高分析效率，提高檢測靈敏度，嚴格保證藥品質(zhì)量安全。