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 提示 

藥物雜質(zhì)是指任何影響藥物純度的物質(zhì),它是反映藥物質(zhì)量的重要指標。藥物中的雜質(zhì)一方面導致藥物活性成分含量降低,影響藥物的治療效果;另一方面毒性雜質(zhì)在用藥過程中會威脅人類的健康。因此必須選擇合適的分析技術(shù)進行研究,確定其來源,并對其結(jié)構(gòu)進行鑒定。液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)靈敏度高、專屬性強、重現(xiàn)性好,能提供豐富的結(jié)構(gòu)信息,是目前藥物雜質(zhì)結(jié)構(gòu)鑒定分析領(lǐng)域應(yīng)用最為廣泛的一種技術(shù)。本文對近年來液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)在抗生素藥物、喹諾酮類藥物、沙坦類藥物及其他藥物中雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)鑒定方面進行綜述,并對其發(fā)展趨勢進行展望。

任何影響藥物純度的物質(zhì)統(tǒng)稱為雜質(zhì)。藥物中含有雜質(zhì)會降低療效和影響穩(wěn)定性,有的甚至對人體健康有害或產(chǎn)生其他不良反應(yīng)。因此,對雜質(zhì)進行檢測,鑒定其可能的結(jié)構(gòu),分析其來源,對控制藥物質(zhì)量至關(guān)重要。藥品研究者、生產(chǎn)者應(yīng)盡可能地明確藥品中各類雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)、來源、毒性、檢測方法以及質(zhì)控限度。按人用藥物注冊技術(shù)要求國際協(xié)調(diào)會(ICH)要求,對原料藥中含量大于0.1%的雜質(zhì)需要進行結(jié)構(gòu)鑒定。能否快速地鑒別出藥物中雜質(zhì)的結(jié)構(gòu),關(guān)系到“雜質(zhì)譜控制”理念應(yīng)用的成敗[3],也是當代藥物分析中的重要內(nèi)容之一。

液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(LC-MS)是20世紀70 年代發(fā)展起來的一門新的儀器分析方法,是一種以液相色譜為主要分離手段,質(zhì)譜法作為檢測手段的色譜檢測技術(shù),集合了液相色譜儀(LC)的高分離能力和質(zhì)譜儀(MS)的高靈敏度、高專屬性的特點,簡化了復雜混合物的分離純化過程。液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)已經(jīng)成為藥物中微量雜質(zhì)分析的首選技術(shù),特別是多級質(zhì)譜和高分辨質(zhì)譜的發(fā)展和應(yīng)用,能夠在線獲得化合物的豐富片段信息和分析組成信息,可根據(jù)一級、二級甚至多級質(zhì)譜信息確定化合物的分子量并推斷出可能分子結(jié)構(gòu),為藥物雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)鑒定提供快速、準確的方法。近二十年來,隨著液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)發(fā)展的日臻完善,其在藥物雜質(zhì)結(jié)構(gòu)鑒定研究中的應(yīng)用也越來越廣泛,展現(xiàn)出廣闊的應(yīng)用前景。本文對近年來液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)在抗生素藥物、喹諾酮類藥物、沙坦類藥物及其他藥物中雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)鑒定方面的研究進行綜述,對其鑒定出的雜質(zhì)進行歸類總結(jié)。

1、β-內(nèi)酰胺類藥

β-內(nèi)酰胺類藥物一般由微生物發(fā)酵產(chǎn)生并經(jīng)純化、精制以及化學修飾等過程制得,主要分為青霉素類、頭孢菌素類等典型的β-內(nèi)酰胺和非典型內(nèi)酰胺如青霉烯、氧頭孢、碳頭孢、單環(huán)內(nèi)酰胺等,這些抗生素的分子結(jié)構(gòu)中均含有β-內(nèi)酰胺環(huán)。分析β-內(nèi)酰胺類抗生素的雜質(zhì)結(jié)構(gòu)應(yīng)首先推測其雜質(zhì)來源。可根據(jù)產(chǎn)品的生產(chǎn)工藝、反應(yīng)條件,以及各種起始物、中間體和終產(chǎn)物的理化性質(zhì),推測產(chǎn)品中可能出現(xiàn)的各種雜質(zhì);也可設(shè)計加速試驗或強制降解試驗如熱、酸、堿、氧化、光照等,使藥物發(fā)生降解,再進行相關(guān)的儀器分析。

了解藥物的MS裂解規(guī)律,有助于對雜質(zhì)結(jié)構(gòu)的推測。雖然不同儀器和不同離子化方式所得到的碎片峰的質(zhì)量數(shù)和離子豐度不完全相同,但是仍有一定規(guī)律可尋。在MS分析中,所有β-內(nèi)酰胺類抗生素共有的裂解反應(yīng)是β-內(nèi)酰胺環(huán)開裂,其他易發(fā)生斷裂的部位有7位側(cè)鏈酰胺鍵、2位碳上的羧基、氨噻肟頭孢菌素亞氨結(jié)構(gòu)上的甲氧基等。

近年來,采用LC-MS分析并鑒定β-內(nèi)酰胺類抗生素雜質(zhì)結(jié)構(gòu)的報道很多,表1總結(jié)了近20年來該類藥物的雜質(zhì)結(jié)構(gòu)鑒定情況。

2、氨基糖苷類藥物

氨基糖苷類藥物是由氨基環(huán)醇、氨基糖和糖組成的抗生素總稱,其化學結(jié)構(gòu)都是以氨基環(huán)醇與氨基糖縮合而成的苷。氨基糖苷類抗生素易發(fā)生耳毒性損害、藥熱性死亡及腎損害,這與其相關(guān)雜質(zhì)有必然的聯(lián)系。由于該類抗生素結(jié)構(gòu)中不具備特征的紫外發(fā)色團,不宜采用紫外檢測器進行相關(guān)雜質(zhì)研究。利用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)鑒定該類抗生素的雜質(zhì)結(jié)構(gòu),有助于分析其引起不良反應(yīng)的起因。

硫酸慶大霉素是氨基糖甙類廣譜抗生素,由小單孢菌發(fā)酵經(jīng)提煉而得,含多種有效成分和雜質(zhì)。林梅建立了硫酸慶大霉素LC-MS 方法,根據(jù)質(zhì)譜碎片并結(jié)合相關(guān)文獻,推斷出硫酸慶大霉素產(chǎn)品中含有加納糖胺、慶大霉素A3、慶大霉素X2、慶大霉素B、慶大霉胺C2、JI-20A、Ⅶ-3、慶大霉胺C2a、慶大霉素B1和西索霉素等有關(guān)物質(zhì),為硫酸慶大霉素實際生產(chǎn)和質(zhì)量控制提供科學依據(jù)。楊昊等建立高效液相色譜-電噴霧-離子阱色譜法(HPLC-ESI-IT-MSn)法研究慶大霉素C1a 原料中的雜質(zhì)譜,明確了慶大霉素C1a樣品中含有慶大霉素A、慶大霉素B、西索米星、小諾霉素、威達米星或它們的同分異構(gòu)體和同系物,并含有慶大霉素C1a 或上述雜質(zhì)的降解產(chǎn)物。

硫酸奈替米星為半合成的氨基糖甙類抗生素,抗菌譜與慶大霉素相似。袁耀佐等應(yīng)用高效液相色譜-電噴霧-離子阱質(zhì)譜法快速鑒定出硫酸奈替米星樣品中7個有關(guān)物質(zhì)的結(jié)構(gòu),分別為西索米星、去甲基西索米星、1-N-乙基-加洛糖胺、5-O-乙基-奈替米星、2'-N-乙基-奈替米星、3″-N-乙基-奈替米星和3-N-丙基-依替米星。

小諾霉素又稱相模霉素或沙加霉素,是由小單孢菌產(chǎn)生的氨基糖苷類抗生素,是慶大霉素C2b組分。袁耀佐等用寬pH 范圍的Gemini NX C18 (4.6mm×150 mm,5 μm)色譜柱,采用診斷碎片離子推斷策略的結(jié)構(gòu)推定方法,從硫酸小諾霉素原料中檢出15個有關(guān)物質(zhì),并對其中的14 個物質(zhì)結(jié)構(gòu)進行歸屬。

3、四環(huán)素類藥物

四環(huán)素類藥物是一類以含有四個芳香環(huán)的并四苯為結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)的廣譜抗生素,由于藥物本身的結(jié)構(gòu)特點,其對各種氧化劑、酸和堿都不穩(wěn)定。該類抗生素在生產(chǎn)和貯存過程中以及進入環(huán)境后發(fā)生降解會產(chǎn)生一些代謝和降解產(chǎn)物,主要是差向異構(gòu)體和脫水產(chǎn)物。李秀琴等采用超高效液相色譜-高分辨飛行時間質(zhì)譜(UPLC-HRTOF/MS)鑒定出四環(huán)素中的4 種雜質(zhì),分別為差向四環(huán)素、金霉素、差向脫水四環(huán)素和脫水四環(huán)素。

多西環(huán)素又名強力霉素或脫氧土霉素,是一種多以土霉素作為起始原料的半合成抗生素。楊帆等[29]利用LCMS-IT-TOF/MS質(zhì)譜儀獲得多西環(huán)素雜質(zhì)F的[M+H]+ 為m/z 444.165 4,MS3、MS4、MS5 前體離子為m/z 366.136 4、293.080 7、278.067 2,推測出其可能的質(zhì)譜裂解途徑和分子結(jié)構(gòu)。張錦琳等應(yīng)用在線脫鹽-高效液相色譜-離子阱-飛行時間質(zhì)譜(2D-LC-IT-TOF/MS) 法鑒定4個鹽酸多西環(huán)素片的有關(guān)物質(zhì)結(jié)構(gòu),分別為4-表多西環(huán)素、美他環(huán)素、β-多西環(huán)素、2-乙酰-6-脫碳酰胺多西環(huán)素。

金霉素是由鏈霉菌產(chǎn)生的一種四環(huán)素類抗生素,主要作為獸用抗生素大量使用。方東升應(yīng)用液相色譜-電噴霧離子化質(zhì)譜法分析飼料級金霉素樣品的雜質(zhì)組分,并根據(jù)各組分的準分子離子峰[M+H]+鑒定出該樣品中含有四環(huán)素、差向異構(gòu)四環(huán)素和差向異構(gòu)金霉素雜質(zhì)等組分。

4、大環(huán)內(nèi)酯類藥物

大環(huán)內(nèi)酯類藥物按其母核結(jié)構(gòu),主要可分為十四元環(huán)和十六元環(huán)兩大類:前者主要為紅霉素及其衍生物,后者主要為螺旋霉素和吉他霉素的衍生物。大環(huán)內(nèi)酯類抗生素雜質(zhì)基本保留了原藥分子的骨架結(jié)構(gòu),因此大多具有相似的質(zhì)譜裂解途徑、中性丟失(H2O、CH3OH 等)和碎片離子(糖基片段、內(nèi)酯環(huán)片段等)。

許卓妮等通過Orbitrap Elite 高分辨質(zhì)譜儀對阿奇霉素降解產(chǎn)物進行高分辨元素組成分析和二級質(zhì)譜的測定,研究其中4個主要降解產(chǎn)物并推測其結(jié)構(gòu),認為阿奇霉素經(jīng)酸降解和高溫破壞得到的雜質(zhì)主要是去氧糖胺基阿奇霉素,經(jīng)氧化降解的雜質(zhì)主要是阿奇霉素-N-氧化物,經(jīng)堿破壞的主要產(chǎn)物為內(nèi)酯環(huán)開環(huán)水解、脫水或糖基片段丟失。

Wang等[35]采用《中國藥典》2010年版項下的液相色譜條件、正電離模式的電噴霧離子源串聯(lián)質(zhì)譜法對乙酰螺旋霉素中的未知組分進行解析,共檢出主組分在內(nèi)的83種組分,其中包括31種新雜質(zhì)和31種部分解析的雜質(zhì) (異構(gòu)體或者糖基變異);主要雜質(zhì)來源于起始原料和合成工藝。

Leonard等利用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法檢測克拉霉素原料藥中的11種有關(guān)物質(zhì),通過二級質(zhì)譜和三級質(zhì)譜的碎片離子信息,確定各相關(guān)化合物的結(jié)構(gòu),其中包括9 位羰基碳被氮原子取代形成的雜質(zhì)。

Chitneni等利用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法鑒定紅霉素降解雜質(zhì)的結(jié)構(gòu),其中紅霉素經(jīng)酸降解時6、9位和9、12位連接成環(huán),形成脫水紅霉素C雜質(zhì),經(jīng)堿降解時內(nèi)酯環(huán)斷裂形成偽紅霉素E烯醚雜質(zhì)。

vanden Bossche等利用液質(zhì)聯(lián)用儀鑒定出交沙霉素中的18個有關(guān)物質(zhì),其中包括羥基移到13位產(chǎn)生的雜質(zhì),還有雙鍵位置在9、10位和11、12位分別產(chǎn)生的雜質(zhì)。

5、喹諾酮類藥物

喹諾酮類,又稱吡酮酸類或吡啶酮酸類,是一類含4-喹諾酮基本結(jié)構(gòu)的人工合成抗菌藥。該類藥物的不良反應(yīng)在很大程度上與藥物的母核結(jié)構(gòu)、取代基的種類和取代位置等相關(guān)。對喹諾酮類藥物中雜質(zhì)進行系統(tǒng)的分析研究,鑒定其結(jié)構(gòu),對提高雜質(zhì)控制標準,保證臨床療效和病人用藥安全均有重要的意義。

王維劍等通過HPLC-MS對左氧氟沙星經(jīng)酸、氧化、光照破壞的樣品進行分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)左氧氟沙星酸降解產(chǎn)物為去羧基左氧氟沙星,氧化降解產(chǎn)物為左氧氟沙星-N-氧化物,兩個光照降解產(chǎn)物分別為去甲基左氧氟沙星、左氧氟沙星-N-氧化物。

鄭亞杰采用LC-HRMS/MS聯(lián)用技術(shù),建立適用于喹諾酮類藥物中微量或未知雜質(zhì)的整合性結(jié)構(gòu)分析方法,對左氧氟沙星、環(huán)丙沙星和莫西沙星經(jīng)強制破壞試驗處理后的樣品進行綜合分析,并鑒定出5個左氧氟沙星相關(guān)雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)。另外,該研究對莫西沙星和環(huán)丙沙星等一批代表性的喹諾酮類藥物,以及經(jīng)過強制破壞試驗處理后的樣品進行綜合分析,一共鑒定出5個莫西沙星相關(guān)雜質(zhì)和13個環(huán)丙沙星相關(guān)雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)。

賀玖明等采用高分辨液相色譜(RRLC)對莫西沙星原料在30% H2O2 中的氧化降解產(chǎn)物進行分離,分別設(shè)定高低碰撞能量的TOF-MS實驗采集質(zhì)譜數(shù)據(jù),獲取母離子與碎片離子等質(zhì)譜信息,從而得到10個該藥物降解雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)及相對含量。

黃婧等采用高效液相色譜-三重串聯(lián)四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀測定依諾沙星的有關(guān)物質(zhì)準確母離子及子離子,并結(jié)合裂解規(guī)律、對照品和依諾沙星生產(chǎn)工藝,對3種主要有關(guān)物質(zhì)進行結(jié)構(gòu)推定,認為三者均具有依諾沙星的1,8-萘啶母核結(jié)構(gòu)。

6、沙坦類藥物

沙坦類藥物即血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑類抗高血壓藥物,是繼血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑之后的一類新型降壓藥。沙坦類藥物的雜質(zhì)研究多是通過HPLC法進行。近年來,隨著液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)的應(yīng)用越來越廣泛,分析并鑒定該類藥物雜質(zhì)結(jié)構(gòu)的報道越來越多。

纈沙坦是由瑞士諾華公司開發(fā),1996年獲美國FDA 批準,是目前全球處方量最大的沙坦類藥物。劉朝霞等對8個廠家的175批纈沙坦膠囊進行有關(guān)物質(zhì)的檢測分析,并采用LC-MS/MS技術(shù)分析推斷出纈沙坦雜質(zhì)F的結(jié)構(gòu),命名為纈沙坦乙酯。王燕等采用LC-MS/MS法對復方纈沙坦氨氯地平片中有關(guān)物質(zhì)進行定性分析,并根據(jù)有關(guān)物質(zhì)的PDA 譜、質(zhì)譜母離子及子離子譜進行解析,鑒別出11個復方纈沙坦氨氯地平片中有關(guān)物質(zhì)的結(jié)構(gòu)。

吳強等采用四級桿復合線性離子阱液質(zhì)聯(lián)用儀對阿齊沙坦的光降解產(chǎn)物和酸降解產(chǎn)物進行結(jié)構(gòu)推測,鑒定出光降解主要產(chǎn)物為1-( ( 2'-1H-雙吖丙啶-3-基-[1,1'-聯(lián)苯]-4-基) 甲基)-2-乙氧基-1H-苯并[d]咪唑-7-羧酸,酸降解主要產(chǎn)物為2-氧代-3-(( 2'-(5-氧代-4,5-二氫-1,2,4- 噁二唑酮-3-基)-[1,1'-聯(lián)苯]-4-基)甲基)-2,3-二氫-1H-苯并[d]咪唑-4-羧酸。

方玉玲等采用液相色譜-光電二極管陣列檢測器-四極桿飛行時間質(zhì)譜聯(lián)用(LC-PDA-QTOF--MS) 對氯沙坦鉀中工藝雜質(zhì)進行結(jié)構(gòu)確認及分析,確定氯沙坦鉀成品質(zhì)量的RRT 1.12雜質(zhì)為氯沙坦羧酸衍生物,該雜質(zhì)產(chǎn)生的主要原因是反應(yīng)過程中關(guān)鍵原料氯腈進行四氮唑反應(yīng)不完全,在后處理過程中水解產(chǎn)生的。

7、其他藥

隨著液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)不斷地成熟,在進行雜質(zhì)譜研究的過程越來越多的研究者更傾向于利用該技術(shù)進行結(jié)構(gòu)鑒定。彭玉薇等采用高效液相色譜離子肼質(zhì)譜串聯(lián)技術(shù)在線鑒定氨氯地平原料藥中未知雜質(zhì)的結(jié)構(gòu),得到3個未知雜質(zhì)分別為二甲酯式氨氯地平、甲酯異丙酯式氨氯地平、異丙酯乙酯式氨氯地平。庾莉菊等采用超高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(UPLC-MS/MS)對青蒿素樣品中的主要雜質(zhì)進行結(jié)構(gòu)確認,其中雜質(zhì)Ⅰ為青蒿烯,雜質(zhì)Ⅱ可能為青蒿素的異構(gòu)體。熊婧等采用超高壓液相-質(zhì)譜(UPLC-MS)聯(lián)用技術(shù)鑒定鹽酸芐絲肼中的未知雜質(zhì)為鹽酸三羥芐基芐絲肼。彭琳等采用液質(zhì)聯(lián)用-電噴霧負離子模式,通過比較雜質(zhì)和對照品的質(zhì)荷比對注射用蘭索拉唑的雜質(zhì)進定性研究。吳川彥等采用高效液相-飛行時間-質(zhì)譜法(HPLC-Q-TOF-MS)對米諾地爾及凝膠有關(guān)物質(zhì)的分析,推斷出8個雜質(zhì)的結(jié)構(gòu),均為新發(fā)現(xiàn)的降解產(chǎn)物。

8、展望

液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)將高分離能力的色譜技術(shù)和高定性能力的質(zhì)譜技術(shù)相結(jié)合,不但擁有色譜法的優(yōu)點,還彌補了色譜法的一些不足。該技術(shù)在使用色譜法對藥物中的有關(guān)物質(zhì)進行有效分離的基礎(chǔ)上,進一步利用一級、二級甚至多級質(zhì)譜碎片信息推測其有關(guān)物質(zhì)的結(jié)構(gòu),提高定性能力,避免傳統(tǒng)的分離、制備等較為繁瑣的前處理過程,更有利于多組分的藥物識別。隨著液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)的不斷進步,該技術(shù)已成為能夠快速準確地發(fā)現(xiàn)及鑒定藥物中雜質(zhì)結(jié)構(gòu)的最優(yōu)方法。

液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)盡管在藥物及雜質(zhì)分析領(lǐng)域表現(xiàn)出一定的優(yōu)勢,但在實際的應(yīng)用中同樣也存在一定的問題與不足,需要進一步的完善。該技術(shù)在通過二級或多級質(zhì)譜碎片信息進行結(jié)構(gòu)推導時,無法對結(jié)構(gòu)中部分基團的位置或空間構(gòu)型進行確定;而且得到的質(zhì)譜信息量大,需要較為繁瑣的數(shù)據(jù)處理過程,尚未有較為全面的數(shù)據(jù)庫可查詢,這是利用該技術(shù)進行結(jié)構(gòu)鑒定的一個缺陷。由于雜質(zhì)在樣品中含量極微,用富集的制備方法獲得雜質(zhì)精制品的工作量大,甚至還需要特殊的設(shè)備,成為藥物雜質(zhì)譜研究的瓶頸所在。期待有更先進的分析手段來加速發(fā)展并推動這方面工作的深入研究。