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所有生物除朊病毒外都含有核酸，核酸包括脫氧核糖核酸（DNA）和核糖核酸（RNA），新型冠狀病毒是一種僅含有RNA的病毒，病毒中特異性RNA序列是區(qū)分該病毒與其它病原體的標(biāo)志物。新型冠狀病毒出現(xiàn)后，我國科學(xué)家在極短的時間里完成了對新型冠狀病毒全基因組序列的解析，并通過與其它物種的基因組序列對比，發(fā)現(xiàn)了新型冠狀病毒中的特異核酸序列。臨床實驗室檢測過程中，如果能在患者樣本中檢測到新型冠狀病毒的特異核酸序列，應(yīng)提示該患者可能被新型冠狀病毒感染。

檢測新型冠狀病毒特異序列的方法最常見的是熒光定量PCR（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）。因PCR反應(yīng)模板僅為DNA，因此在進(jìn)行PCR反應(yīng)前，應(yīng)將新型冠狀病毒核酸（RNA）逆轉(zhuǎn)錄為DNA。在PCR反應(yīng)體系中，包含一對特異性引物以及一個Taqman探針，該探針為一段特異性寡核苷酸序列，兩端分別標(biāo)記了報告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)。探針完整時，報告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號被淬滅基團(tuán)吸收；如反應(yīng)體系存在靶序列，PCR反應(yīng)時探針與模板結(jié)合，DNA聚合酶沿模板利用酶的外切酶活性將探針酶切降解，報告基團(tuán)與淬滅基團(tuán)分離，發(fā)出熒光。每擴(kuò)增一條DNA鏈，就有一個熒光分子產(chǎn)生。熒光定量PCR儀能夠監(jiān)測出熒光到達(dá)預(yù)先設(shè)定閾值的循環(huán)數(shù)（Ct值）與病毒核酸濃度有關(guān)，病毒核酸濃度越高， Ct值越小。不同生產(chǎn)企業(yè)的產(chǎn)品會依據(jù)自身產(chǎn)品的性能確定本產(chǎn)品的陽性判斷值。

對于新型冠狀病毒的核酸檢測，首先根據(jù)試劑盒說明書【樣本要求】部分進(jìn)行樣本采集，常規(guī)的樣本類型包括咽拭子、鼻拭子、痰液、支氣管灌洗液、肺泡灌洗液等。由于新型冠狀病毒為RNA病毒，RNA易降解，因此，采集樣本時使用無RNA酶的拭子和無RNA酶的儲存管。獲得患者樣本后，需盡快進(jìn)行檢測，如無法立即檢測需要轉(zhuǎn)運的樣本，應(yīng)按照說明書的要求進(jìn)行低溫封裝，并送到專門的檢測機(jī)構(gòu)進(jìn)行檢測。檢測機(jī)構(gòu)收到樣本后，對樣本進(jìn)行核酸提取，核酸提取試劑應(yīng)使用批準(zhǔn)產(chǎn)品說明書中指定的核酸提取試劑盒。

（圖：咽拭子取樣示意圖）

病毒RNA需要首先逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，再進(jìn)行擴(kuò)增檢測。PCR擴(kuò)增和檢測應(yīng)使用批準(zhǔn)產(chǎn)品說明書中指定的熒光定量PCR儀，通過熒光定量PCR所得到的樣本Ct值的大小，可以判斷患者樣本中是否含有新型冠狀病毒。

上述過程中樣本的采集、保存、轉(zhuǎn)運，樣本核酸的提取和檢測、結(jié)果的判讀均須嚴(yán)格按照試劑盒說明書要求進(jìn)行。

（一）全流程的質(zhì)量控制

在新型冠狀病毒的檢測過程中，三個最為關(guān)鍵的要素是人員，實驗室和試劑盒。

首先，核酸檢測的整個檢測流程操作復(fù)雜，不同產(chǎn)品因存在不同反應(yīng)體系及適用機(jī)型等因素，操作過程中試驗人員應(yīng)按照各自產(chǎn)品說明書要求進(jìn)行。

實驗室檢測往往從樣本提取開始，但實際上，要保證樣本的檢測準(zhǔn)確，應(yīng)從患者樣本的采集開始進(jìn)行質(zhì)量控制，并對后續(xù)各個流程規(guī)范操作（如樣本的保存、轉(zhuǎn)運等）。有研究表明，不同人員對同一患者的樣本進(jìn)行采集，可能存在不同的檢測結(jié)果。試劑在保存、運輸及使用過程中操作不當(dāng)均可能影響其檢測結(jié)果。因此，需要嚴(yán)格按照說明書的規(guī)定操作。

其次，新型冠狀病毒傳播能力強(qiáng)，危險系數(shù)高，個人防護(hù)應(yīng)為生物安全三級實驗室級別。每個操作人員必須具備專業(yè)技能且擁有PCR檢驗資質(zhì)。整個操作過程中需防范氣溶膠污染對人員的感染風(fēng)險，并做到準(zhǔn)確加樣和正確使用試劑和耗材。

最后，為防止病毒擴(kuò)散，檢測新型冠狀病毒的實驗室必須達(dá)到生物安全二級（P2）及以上實驗室條件，實驗室管理應(yīng)嚴(yán)格按照PCR基因擴(kuò)增實驗室的管理規(guī)范，實驗操作必須嚴(yán)格分區(qū)，各區(qū)域使用的儀器、設(shè)備、耗材和工作服必須專用，不得交叉使用，避免污染。

所有檢測樣本應(yīng)視為具有傳染性物質(zhì)，實驗過程中穿工作服，戴一次性手套并經(jīng)常替換手套以避免樣本間的交叉污染；樣本操作、廢棄物處理均需符合衛(wèi)生部《微生物生物醫(yī)學(xué)實驗室生物安全通用準(zhǔn)則》和《醫(yī)療廢物管理條例》等相關(guān)法規(guī)要求。

（二）檢測結(jié)果判斷要求

目前批準(zhǔn)產(chǎn)品均基于新型冠狀病毒基因組中開放讀碼框1a/b（open reading frame 1ab，ORF1ab）、包膜蛋白（Envelope protein，E）和核衣殼蛋白（nucleocapsid protein，N）進(jìn)行選擇。不同產(chǎn)品的檢測原理基本一致，但是其引物、探針設(shè)計存在不同，有單靶區(qū)段（ORF1ab）、雙靶區(qū)段（ORF1ab、N蛋白）、三靶區(qū)段（ORF1ab、N蛋白和E蛋白）的檢測和判讀差別。建議使用者應(yīng)嚴(yán)格按照不同企業(yè)說明書規(guī)定的判讀方式進(jìn)行判讀。

依據(jù)《新型冠狀病毒感染的肺炎診療方案（試行第五版）》確診病例要求，臨床診斷病例或疑似病例，具備以下病原學(xué)證據(jù)之一者：1.呼吸道標(biāo)本或血液標(biāo)本實時熒光RT-PCR檢測新型冠狀病毒核酸為陽性；2.呼吸道標(biāo)本或血液標(biāo)本病毒基因測序，與已知的新型冠狀病毒高度同源。

如臨床人員對檢測結(jié)果感覺明顯不符。建議對整個檢測環(huán)節(jié)（如：對樣本的采集、轉(zhuǎn)動及處理等環(huán)節(jié)）進(jìn)行分析。應(yīng)關(guān)注檢測結(jié)果為陰性的患者，不排除新型冠狀病毒早期感染或其他呼吸道病毒感染等。如條件允許，建議采集痰液或肺泡灌洗液等敏感性更高的樣本進(jìn)行復(fù)測。