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高效液相方法驗證項目與進樣方式討論

嘉峪檢測網(wǎng) 2020-02-17 09:30

高效液相是目前在分析、檢測中廣泛使用的最基本檢驗儀器之一，尤其是藥檢行業(yè)中。根據(jù)現(xiàn)行的法規(guī)，即使是藥典收載的高效液相方法，考慮到不同企業(yè)間生產(chǎn)工藝、檢測水平的差異，也需要進行全面的方法驗證。結(jié)合大量的文章和個人經(jīng)驗，本文對高效液相方法驗證項目與進樣方式進行了簡單的討論。

1、最新法規(guī)要求

高效液相檢驗的一般目的在于鑒別、有關(guān)物質(zhì)檢查、含量測定這3個主要目的，《中國藥典》對于不同的使用用途下各驗證項目有著詳細(xì)的規(guī)定[1]。而生物基質(zhì)（如全血、血清、血漿、尿）的色譜分析方法驗證要求詳見《通則9012生物樣品定置分析方法驗證指導(dǎo)原則》[2]。隨著監(jiān)管機構(gòu)法律法規(guī)的不斷更新，其對于方法驗證的要求與ICH、FDA、EMA等不斷接近，科學(xué)性和可操作性也有提升[3]。

根據(jù)最新的藥典修訂計劃，《中國藥典》2020年版擬將通則9101改名為“分析方法驗證指導(dǎo)原則”，在驗證項中著重突出專屬性的要求（驗證指標(biāo)調(diào)整至第一項），刪除校正因子，各項目的驗證要求也根據(jù)新的監(jiān)管要求發(fā)生了變化，檢測項目和驗證指標(biāo)見表1[4]。

表1《中國藥典》2020年版《分析方法驗證指導(dǎo)原則》中驗證項目[4]

高效液相方法驗證項目與進樣方式討論

2、高效液相方法驗證一般方案討論

對于新的分析方法指導(dǎo)原則，僅需要著重指出的是專屬性被調(diào)至方法驗證的第一項，突出了專屬性的重要性，因此在方法驗證中需要考慮。本文接下來結(jié)合個人理解，選取藥檢領(lǐng)域最常用高效液相含量測定方法驗證進行一般方案的討論，見表2。

表2 高效液相含量測定方法驗證一般方案討論

#	驗證項目	進樣方式	考察要點
1	專屬性	流動相空白、基質(zhì)空白、對照品、供試品、與供試品相似樣品、供試品破壞樣品，各進樣1次。	分離度峰純度
2	準(zhǔn)確度	供試品測量范圍50、80、100、120、150%（或者擴大方法驗證范圍50、75、100、150、200%）的樣品，以及分別與相同濃度對照品1:1混合，供試品和供試品加標(biāo)樣品各測定3次，計算回收率和回收率RSD。	回收率及其RSD
3	精密度-重復(fù)性	合并使用準(zhǔn)確度項目中梯度濃度供試品的數(shù)據(jù)，計算含量RSD	含量RSD
4	精密度-中間精密度	按照準(zhǔn)確度項目中梯度濃度供試品，由另一名實驗員各測定3次，計算批間含量RSD	含量RSD
5	線性	合并使用準(zhǔn)確度項目中梯度濃度供試品的數(shù)據(jù)，進行線性擬合	R² 截距響應(yīng)因子RSD
6	范圍	合并使用準(zhǔn)確度項目中梯度濃度供試品的數(shù)據(jù)	根據(jù)線性、準(zhǔn)確度、精密度結(jié)果和要求確定
7	耐用性	輕微改變流動相比例、pH值、柱溫、流速、不同廠家批號色譜柱、不同儀器等，每個條件測試2次，與標(biāo)準(zhǔn)條件比較含量RSD（可合并使用準(zhǔn)確度項目中100%濃度供試品的數(shù)據(jù)）	根據(jù)風(fēng)險評估結(jié)果確定
8	檢測限、定量限	S/N=3和S/N=10，需結(jié)合理論計算結(jié)果制備低濃度驗證樣品驗證S/N	S/N 驗證樣品通常檢測限應(yīng)低于限度的1/30，定量限應(yīng)低于限度的1/10[5]
9	系統(tǒng)適用性	以對照品溶液重復(fù)進樣5次，考察系統(tǒng)適用性指標(biāo)	理論板數(shù)N 分離度R 拖尾因子T 重復(fù)性靈敏度

注：

1、耐用性：耐用性的驗證理論上可以無限做下去，甚至到方法重現(xiàn)、方法轉(zhuǎn)移都與耐用性有著相通的原理，因此個人認(rèn)為應(yīng)該進行一個風(fēng)險評估以確定需要著重考察的項目，或者在方法開發(fā)階段予以解決。

2、檢測限、定量限：對于含量檢測不需要驗證，但其原理與系統(tǒng)適用性中靈敏度具有相似性，可以作為該色譜系統(tǒng)條件評估的一個指標(biāo)，個人認(rèn)為可以制備低濃度的樣品進行驗證，而在有關(guān)物質(zhì)檢查中則要重點考慮檢測限和定量限。

3、系統(tǒng)適用性：應(yīng)加強對高效液相系統(tǒng)適用性試驗的重視程度，如在《中國藥典分析檢測技術(shù)指南》中規(guī)定：以色譜中最難分離物質(zhì)對或與其相關(guān)的物質(zhì)對的分離度和待測物質(zhì)的精密度作為系統(tǒng)適用性試驗首選參數(shù)[7]。

4、方法驗證中的合并設(shè)計大家在操作中多少都會用，如覺得不穩(wěn)妥可以考慮樣品測量次數(shù)由3次增加到6次，但合并設(shè)計涉及的法規(guī)風(fēng)險和合規(guī)性尚需要細(xì)致的分析，這里是一個理念先拿出來。

5、高效液相含量分析方法驗證的可接受標(biāo)準(zhǔn)可參照CDE電子刊物[8]，研究時結(jié)合實際檢測結(jié)果進行可接受標(biāo)準(zhǔn)調(diào)整。

3、案例分析

3.1鑒定（肽圖）

表3 抗人TNF-α單克隆抗體液質(zhì)聯(lián)用肽圖方法驗證案例[9]

#	驗證項目	進樣方式	考察要點
1	專屬性	TNF-α單抗、利妥昔單抗（不同種單抗）、基質(zhì)對照（成品輔料溶液）	保留時間
2	系統(tǒng)適用性（文中稱-重復(fù)性）	同一TNF-α單抗樣品消化溶液進樣5次，計算CDR相對保留時間的RSD	CDR相對保留時間RSD
3	中間精密度	由2名不同人員在不同時間分別制備4份、2份TNF-α單抗消化溶液，計算CDR相對保留時間的RSD	CDR相對保留時間RSD
4	耐用性	對胰蛋白酶酶切條件（酶比例、酶切時間）進行了考察，計算CDR相對保留時間的RSD	CDR相對保留時間RSD
5	穩(wěn)定性	分別考察了TNF-α單抗消化溶液在（8℃）的儲存穩(wěn)定性及-20℃的凍存穩(wěn)定性，考察CDR相對保留時間的SD和RSD	CDR相對保留時間SD和RSD

注：

1、本方法驗證時增加了相應(yīng)的精密度指標(biāo)，選取特征的CDR相對保留時間作為精密度指標(biāo)，增加了鑒別實驗中的重復(fù)性指標(biāo)，并提高了實際驗證的可行性，值得學(xué)習(xí)。

3.2雜質(zhì)（純度）

表4 貝伐單抗純度（分子大小變異體）的方法學(xué)驗證（USP-MP）案例[10]

#	驗證項目	進樣方式	考察要點
1	專屬性	基質(zhì)對照（成品輔料溶液）、貝伐單抗標(biāo)準(zhǔn)品、貝伐單抗在55℃熱處理2h的專屬性樣品	分離度
2	重復(fù)性	同1名實驗員進行6次獨立檢驗，計算峰面積RSD	峰面積RSD
3	中間精密度	2名實驗員在2天各進行6次獨立檢驗，計算批批間峰面積RSD	峰面積RSD
4	線性、范圍和準(zhǔn)確度	制備測量范圍50、75、100、150、200%的樣品，各進行6次獨立檢驗，計算各個點的反算回收率和RSD，計算置信度。	反算回收率和RSD置信度。

注：

1、本方法驗證參照了部分合并設(shè)計原則，而且已然是上市的藥物的公開數(shù)據(jù)（USP-MP），具有一定的參考意義。

4、小結(jié)

對于高效液相而言，一般認(rèn)為即使是法定方法，也需開展方法驗證。方法驗證項目按照新的方法驗證指導(dǎo)原則進行選擇即可，值得注意的是需要著重突出專屬性。對于指導(dǎo)原則沒有涉及到的項目，可結(jié)合風(fēng)險評估原則適當(dāng)增加方法驗證項目。至于進樣方式上可以進一步地參考合并設(shè)計的原則，在滿足數(shù)據(jù)量的前提下，進一步提高方法驗證設(shè)計的科學(xué)性和簡便性。

參考文獻：

[1]《中國藥典》2015年版，通則9101藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗證指導(dǎo)原則.

[2]《中國藥典》2015年版，通則9012生物樣品定置分析方法驗證指導(dǎo)原則.

[3]許明哲,黃寶斌, 楊青云,等. 分析方法驗證、轉(zhuǎn)移和確認(rèn)概念解析[J].藥物分析雜志, 2015, 16(1):168-175.

[4]國家藥典委員會,《中國藥典》2020年四部通則增修訂內(nèi)容（第二十二批）,9101 分析方法驗證指導(dǎo)原則（第二次征求意見稿）.

[5]梅希,2020版藥典9101<分析方法驗證指導(dǎo)原則>要點淺析,藥事縱橫,2019年6月3日。

[6]alamo, 高效液相檢驗時重復(fù)樣與進針次數(shù)討論,藥事縱橫, 2019年11月20日.

[7]國家藥典委員會.中國藥典分析檢測技術(shù)指南[S]. 北京:中國醫(yī)藥科技出版社. 2017年,187-188.

[8]黃曉龍.含量測定分析方法驗證的可接受標(biāo)準(zhǔn)簡介.CDE電子刊物，2006年01月20日.

[9]桂芳,楊蘭蘭, 潘勇兵,等. 抗人TNF-α單克隆抗體液質(zhì)聯(lián)用肽圖分析方法的建立及驗證[J].藥物分析雜志,2017,37(1):58-70.

[10]BEVACIZUMAB Summary Validation Report. February 28, 2014. Published on USP Medicines Compendium (https://mc.usp.org).

來源：藥事縱橫

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