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作者：王琰，張培培 1, 姚尚辰 1, 尹利輝 1, 林蘭 , 張彥民 2, 胡昌勤 1     

1. 中國(guó)食品藥品檢定研究院, 北京 102629;

2. 西安交通大學(xué)藥學(xué)院, 西安 710061

 

 

 

摘要：

目的: 藥品中外源性殘留蛋白不僅影響藥品質(zhì)量，且嚴(yán)重威脅人用藥安全。青霉素G酰基轉(zhuǎn)移酶（簡(jiǎn)稱(chēng)PGA）是酶法工藝生產(chǎn)β-內(nèi)酰胺抗生素過(guò)程中所用關(guān)鍵催化酶，有必要對(duì)其進(jìn)行研究并嚴(yán)格控制終產(chǎn)品中的蛋白殘留量。已有方法采用凝膠過(guò)濾法（GFC）對(duì)殘留蛋白進(jìn)行前處理，但該法存在富集效率低等諸多問(wèn)題。本文探討并嘗試建立一種不同方式和原理的蛋白分離、富集方法，采用超濾前處理結(jié)合考馬斯亮藍(lán)（Bradford）法測(cè)定酶法工藝產(chǎn)品阿莫西林中殘留蛋白的含量。方法: 采用Amicon®Ultra-15型超濾管（15 mL，截留分子量為3 kDa）對(duì)阿莫西林供試液進(jìn)行前處理，離心力為5000 g（7000rpm），對(duì)溶液進(jìn)行凈化并對(duì)蛋白進(jìn)行濃縮富集，再采用Bradford法對(duì)濃縮液進(jìn)行蛋白定量測(cè)定，檢測(cè)波長(zhǎng)為595 nm。結(jié)果: 該法具有較好的專(zhuān)屬性；蛋白濃度在1.0~100.0 μg·mL-1（r=0.9921）內(nèi)校正曲線（lg A~lg C）的線性關(guān)系良好；回收率>72%（n=3×3）；Bradford法最低檢出限為0.1 μg·mL-1，相當(dāng)于0.0001%；Bradford法的精密度≤ 5.0%。結(jié)論: 該方法準(zhǔn)確、可靠，相比于已有方法，蛋白富集量更大、操作簡(jiǎn)便、設(shè)備要求低，可用于酶法工藝阿莫西林中殘留蛋白的測(cè)定，對(duì)酶法工藝半合成抗生素中殘留蛋白的質(zhì)控及酶法工藝穩(wěn)定性監(jiān)測(cè)提供了一定技術(shù)指導(dǎo)。

關(guān)鍵詞：超濾    Bradford法    酶法工藝    阿莫西林    殘留蛋白    含量測(cè)定    

 

阿莫西林(AMO)是一種β-內(nèi)酰胺類(lèi)半合成抗生素(圖 1), 具有高效廣譜抗菌作用, 通過(guò)抑制細(xì)菌細(xì)胞壁黏肽合成酶的活性而使細(xì)菌喪失活性[1]。臨床中主要用于治療革蘭氏陽(yáng)性桿菌和陰性桿菌所致各種感染, 如胃炎、慢性支氣管炎及尿路感染等[2]。阿莫西林的生產(chǎn)一直采用經(jīng)典化學(xué)法, 但該法反應(yīng)步驟多、有機(jī)試劑用量大、會(huì)產(chǎn)生大量的工業(yè)"三廢", 造成嚴(yán)重環(huán)境污染。酶法工藝是一種較新發(fā)展起來(lái)的綠色生物催化技術(shù), 具有反應(yīng)步驟少、反應(yīng)選擇性高和工業(yè)"三廢"產(chǎn)生少等優(yōu)點(diǎn), 2000年后國(guó)際上開(kāi)始大規(guī)模應(yīng)用于β-內(nèi)酰胺抗生素的商業(yè)化生產(chǎn)[3-4]。青霉素G?；D(zhuǎn)移酶(簡(jiǎn)稱(chēng)PGA)是該工藝中用到的關(guān)鍵催化酶, 在這種催化酶的催化作用下, 起始原料6-氨基青霉烷酸(6- APA)可與D-對(duì)羥基苯甘氨酸甲酯(D-HPGM)通過(guò)催化反應(yīng)直接合成阿莫西林。

圖 1 阿莫西林結(jié)構(gòu)式

帝斯曼制藥公司(英文名稱(chēng)DSM)最早開(kāi)始研究酶法工藝技術(shù)并用于阿莫西林的工業(yè)化大生產(chǎn)。目前, 國(guó)內(nèi)已有多個(gè)企業(yè)逐漸采用酶法工藝生產(chǎn)阿莫西林原料。由于該工藝中用到的PGA是一種生物大分子, 已有文獻(xiàn)研究結(jié)果表明[5-6], 大分子外源性蛋白可引起諸多不良反應(yīng), 與藥品安全性密切相關(guān)。另一方面, 我國(guó)企業(yè)的該類(lèi)產(chǎn)品在經(jīng)CDE審評(píng)或出口歐盟時(shí), 質(zhì)控機(jī)構(gòu)要求提供殘留蛋白檢測(cè)數(shù)據(jù), 以證明酶法工藝的可靠性[7-9]。因此, 從藥品質(zhì)控角度和法規(guī)要求兩方面考慮, 均有必要嚴(yán)格監(jiān)控終產(chǎn)品中PGA殘留量。

 

目前, 相關(guān)法規(guī)僅要求注冊(cè)申報(bào)時(shí)應(yīng)提供相關(guān)檢測(cè)數(shù)據(jù), 但未對(duì)相關(guān)檢測(cè)方法提出明確要求。對(duì)于酶法工藝合成阿莫西林, 終產(chǎn)品中殘留蛋白除來(lái)自PGA外, 還可能來(lái)自于起始原料6-APA合成上游發(fā)酵工藝中的宿主蛋白及發(fā)酵液等。當(dāng)較難獲得PGA及相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)品的情況下, 可采用測(cè)定總蛋白方法對(duì)終產(chǎn)品中的殘留蛋白的總量進(jìn)行控制。目前, 有多種蛋白定量檢測(cè)方法, 如考馬斯亮藍(lán)(Bradford)法、福林酚(Lowry)法、凝膠過(guò)濾(GFC)法、質(zhì)譜法等[10-11]。相比于其它方法, Bradford法線性范圍較寬, 靈敏度更高, 適用于低濃度蛋白的測(cè)定, 是一種通用、快速簡(jiǎn)便的檢測(cè)方法[12-13]。但是, 由于阿莫西林結(jié)構(gòu)中含有多個(gè)氨基結(jié)構(gòu), 實(shí)驗(yàn)考察結(jié)果表明氨基會(huì)對(duì)Bradford法產(chǎn)生干擾, 表現(xiàn)為溶液顏色變藍(lán), 不能直接測(cè)定, 因此, 需要對(duì)阿莫西林與殘留蛋白進(jìn)行分離前處理。目前對(duì)抗生素中殘留蛋白進(jìn)行前處理的方法如GFC法[14], 雖能對(duì)殘留蛋白進(jìn)行有效分離與富集, 但對(duì)儀器設(shè)備要求高、分離效果受凝膠色譜柱填料影響大、需多次進(jìn)樣收集, 實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng), 大大影響了實(shí)驗(yàn)效率。超濾技術(shù)是介于微濾和納濾之間的一種膜分離技術(shù), 具有分離、濃縮和凈化等作用, 其截留機(jī)理主要包括膜篩分和靜電作用[15]。不同于GFC法, 超濾法根據(jù)不同截留分子量(MWCO)濾膜對(duì)殘留蛋白進(jìn)行富集, 具有操作更簡(jiǎn)便、儀器要求更低等優(yōu)點(diǎn)[16-18]。本研究依據(jù)阿莫西林(分子量為365.4)和蛋白分子(如PGA是由一個(gè)異質(zhì)二聚體構(gòu)成, 總分子量約8萬(wàn)[19])之間分子量的較大差異, 嘗試采用超濾法對(duì)抗生素樣品進(jìn)行前處理, 目的是將供試品溶液中阿莫西林干擾去除、凈化溶液(降低溶液鹽濃度)和對(duì)樣品中的微量蛋白進(jìn)行濃縮富集。實(shí)驗(yàn)通過(guò)考察不同超濾步驟及準(zhǔn)確性確定最優(yōu)超濾條件, 對(duì)阿莫西林原料中殘留總蛋白進(jìn)行有效分離和富集, 然后采用Bradford法對(duì)蛋白進(jìn)行準(zhǔn)確定量。

 

1 儀器與試藥

Amicon? Ultra-15型超濾管(15 mL, MWCO為3 kDa, 德國(guó)Merk Millipore公司), AllegraTM 64R型高速低溫離心機(jī)(美國(guó)Beckman Coulter公司), Thermo酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo公司), CP225D型電子分析天平(德國(guó)Satorious公司)和Milli-Q Reference型高純水發(fā)生儀(德國(guó)Merk Millipore公司); 96孔板(美國(guó)Corning公司); 20、100、200和1000 μL移液器(德國(guó)Eppendorf公司)。

 

牛血清白蛋白(BSA)標(biāo)準(zhǔn)品(批號(hào)TK269567, 2 mg·mL-1, 美國(guó)Thermo公司); 阿莫西林(6批, 市售); 蛋白染料Bradford試劑(批號(hào)033K9279, 美國(guó)Sigma公司); 碳酸鈉為分析純; 水為Milli-Q超純水。

 

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液配制

2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)品貯備液(Ⅰ)

精密量取BSA標(biāo)準(zhǔn)品適量, 加水溶解并稀釋成濃度為100 µg·mL-1的溶液。

 

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)品貯備液(Ⅱ)

精密量取BSA標(biāo)準(zhǔn)品適量, 加0.04%碳酸鈉(Na2CO3)溶液溶解并稀釋成濃度為100 µg·mL-1的溶液。

 

2.1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液

精密量取標(biāo)準(zhǔn)品貯備液(Ⅰ)適量, 分別加水溶解并稀釋成濃度為0.4、2.0和20.0 µg·mL-1的溶液, 作為標(biāo)準(zhǔn)溶液(Ⅰ)、(Ⅱ)和(Ⅲ)。

 

2.1.4 供試品溶液

精密稱(chēng)取阿莫西林1.0 g, 加4% Na2CO3溶解并稀釋成濃度為100 mg·mL-1的溶液, 待用。

 

2.1.5 4% Na2CO3溶液

精密稱(chēng)取4 g Na2CO3, 加水100 mL溶解并稀釋, 即得。

 

2.1.6 0.04% Na2CO3溶液

精密量取4% Na2CO3溶液適量, 按1:100比例加水稀釋, 即得。

 

2.2 樣品前處理

精密量取待用溶液5 mL置超濾管, 按圖 2中路線1或路線2方法進(jìn)行前處理, 采用5000 g(7000 rpm)離心力超濾, 最終濃縮得上層溶液約1 mL, 待測(cè)。

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圖 2 樣品前處理流程圖（路線1和路線2）

2.3 測(cè)定法

精密量取待測(cè)溶液500 μL, 加入500 μL的Bradford試劑, 混勻, 在室溫下放置5 min, 吸取該溶液150 μL置96孔板中, 于595 nm的波長(zhǎng)下測(cè)定其吸光度值。

 

2.4 專(zhuān)屬性

Bradford蛋白定量法原理為考馬斯亮藍(lán)G-250染料與蛋白質(zhì)的芳香族氨基酸和/或堿性氨基酸結(jié)合, 溶液由紅色變成藍(lán)色, 于595 nm下測(cè)定其吸光度, 進(jìn)而通過(guò)吸光度與已知蛋白質(zhì)濃度關(guān)系測(cè)定未知蛋白質(zhì)的含量[10-11]。由于阿莫西林結(jié)構(gòu)中6位側(cè)鏈含有兩個(gè)堿性氨基(伯氨和仲氨), 會(huì)對(duì)Bradford法測(cè)定產(chǎn)生干擾, 實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn), 阿莫西林可使考馬斯亮藍(lán)染料明顯變藍(lán), 因此, 采用超濾法對(duì)樣品進(jìn)行前處理以除去阿莫西林。實(shí)驗(yàn)采用Amicon? Ultra-15型超濾管, MWCO為3 kDa, 即超濾時(shí)分子量大于3 kDa的大分子均被截留至上層液, 而分子量小于3 kDa的小分子均透過(guò)超濾膜被離心至下層液。阿莫西林分子量約為365 Da, 如果考慮其溶液狀態(tài)下可能形成二聚體甚至三聚體, 其分子量不會(huì)超過(guò)3 kDa。因此, 樣品溶液超濾前處理時(shí), 阿莫西林及其聚合物會(huì)被較好地去除, 上層液中僅保留分子量在3 kDa以上的大分子蛋白, 用于進(jìn)行后續(xù)蛋白專(zhuān)屬測(cè)定。

 

2.5 線性與范圍

精密量取標(biāo)準(zhǔn)品貯備液(Ⅱ)適量置1.5 mL小管, 分別加0.04% Na2CO3溶液稀釋至500 μL, 制成蛋白濃度分別為1.0、5.0、10.0、25.0、50.0和100.0 µg·mL-1的溶液。按"2.3"節(jié)下方法測(cè)定吸光度值, 以lg A(吸光度值的對(duì)數(shù))為縱坐標(biāo), lg C (濃度的對(duì)數(shù))為橫坐標(biāo), 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并得回歸方程。結(jié)果顯示, 回歸方程為lg A=0.6940 lg C- 1.6259, 回歸系數(shù)r為0.9921。表明該方法的蛋白濃度在1.0~100.0 µg·mL-1, 線性關(guān)系良好。

 

2.6 精密度

精密量取"2.5"節(jié)下濃度分別為1.0、5.0、10.0、25.0、50.0和100.0 µg·mL-1蛋白系列溶液各3份置96孔板, 按"2.3"節(jié)下方法測(cè)定吸光度值, 計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。結(jié)果顯示RSD≤2.3% (n=6×3), 表明該方法重復(fù)性良好。取上述蛋白系列溶液同法連續(xù)3天進(jìn)行測(cè)定, 結(jié)果顯示RSD≤5.0%(n=6×3×3), 表明該方法重現(xiàn)性良好。

 

2.7 檢測(cè)限

以0.04% Na 2CO3溶液作空白, 取樣3份, 按"2.3"節(jié)下方法連續(xù)測(cè)定吸光度值, 得均值(ā)和標(biāo)準(zhǔn)差(SD), 分別以ā+3SD和ā+10SD為考察指標(biāo), 計(jì)算該法的LOD和LOQ。該法的LOD為0.1 µg·mL-1, 代入公式1計(jì)算即為0.0001%(相當(dāng)于1 ppm); LOQ為0.6 µg·mL-1, 即0.0003%(相當(dāng)于3 ppm)。表明該法的靈敏度良好。

 

公式1:

 

2.8 準(zhǔn)確度

精密量取標(biāo)準(zhǔn)品貯備液(Ⅰ)適量置1.5 mL小管, 分別采用水和4% Na2CO3溶液做溶劑, 稀釋制成蛋白濃度水平分別為0.2、1.0和10.0 µg·mL-1的溶液, 待用; 再分別精密量取供試品溶液各2.5 mL, 分別加標(biāo)準(zhǔn)溶液(Ⅰ)、(Ⅱ)和(Ⅲ)各2.5 mL, 混勻, 制成蛋白濃度水平分別為0.2、1.0和10.0 µg·mL-1的加樣回收溶液, 待用。分別精密量取上述制備得到的待用溶液各5 mL, 按"2.2"節(jié)下方法中路線1進(jìn)行前處理(圖 2中路線1), 再采用"2.3"節(jié)下方法進(jìn)行測(cè)定, 得到吸光度值, 由"2.5"節(jié)下蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線得到相應(yīng)濃度并計(jì)算回收率。結(jié)果顯示, BSA在3種溶液中的回收率均大于72%(見(jiàn)表 1), 表明回收率良好。

 

表 1 BSA在3種不同溶液中回收率考察結(jié)果 

2.9 樣品測(cè)定

精密量取供試液5 mL, 分別按"2.2"節(jié)下方法中路線1和路線2進(jìn)行前處理, 再精密量取200 μL上層溶液, 加0.04% Na2CO3溶液300 μL混勻, 按"2.3"節(jié)下方法進(jìn)行測(cè)定, 得吸光度值(A), 由"2.5"節(jié)下蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線得到相應(yīng)蛋白濃度(C), 將該值代入公式1計(jì)算樣品中殘留蛋白的量, 結(jié)果見(jiàn)表 2。

 

表 2 采用2種樣品前處理方式測(cè)定得到的阿莫西林中殘留蛋白含量 

3 討論

3.1 樣品超濾前處理?xiàng)l件摸索與考察

由于樣品中殘留蛋白含量低, 為增加檢出效率, 實(shí)驗(yàn)盡可能配制高濃度供試品溶液。由于阿莫西林原料為阿莫西林酸的形式, 無(wú)法溶于水, 根據(jù)生產(chǎn)工藝并結(jié)合實(shí)驗(yàn)考察, 采用4% Na2CO3溶液作為溶劑可較好地溶解阿莫西林酸制備高濃度供試液。但高濃度阿莫西林(100 µg·mL-1)和4% Na2CO3均會(huì)明顯使Bradford試劑變藍(lán), 干擾測(cè)定。因此, 實(shí)驗(yàn)采用超濾法對(duì)樣品中殘留蛋白進(jìn)行濃縮富集并對(duì)溶液進(jìn)行脫鹽置換。

 

實(shí)驗(yàn)考察了不同濃度的阿莫西林供試液和不同濃度的Na2CO3溶液對(duì)Bradford試劑的影響。分別對(duì)100 mg·mL-1阿莫西林供試液和4% Na2CO3溶液按10倍比的稀釋因子(1:10、1:102、1:103、1:104和1:105)逐級(jí)進(jìn)行稀釋, 然后按"2.3"節(jié)下方法測(cè)定各溶液吸光度, 同時(shí)以水作為空白進(jìn)行對(duì)比。結(jié)果顯示, 起始溶液100 mg·mL-1阿莫西林供試液和4% Na2CO3溶液會(huì)導(dǎo)致Bradford試劑明顯變藍(lán)(A>0.5), 隨著2種溶液不斷稀釋, 溶液濃度不斷降低, 其對(duì)Bradford試劑的影響均逐漸下降。當(dāng)4% Na2CO3溶液稀釋10倍(0.4%, 圖 3A虛線所示)、阿莫西林供試液稀釋103倍(此時(shí)溶液中阿莫西林濃度為0.1 mg·mL-1, Na2CO3濃度為0.004%, 圖 3B虛線所示)時(shí), 兩者的吸光度值幾乎與水相當(dāng), 認(rèn)為已無(wú)干擾。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出, 阿莫西林對(duì)Bradford試劑的影響要明顯大于Na2CO3溶液對(duì)Bradford試劑的影響, 是超濾前處理步驟設(shè)計(jì)中應(yīng)考慮的主要影響因素。

 

圖 3 4% Na2CO3溶液和阿莫西林供試液不同稀釋因子吸光度曲線圖

 

以此實(shí)驗(yàn)結(jié)果為依據(jù), 設(shè)計(jì)超濾前處理步驟, 離心力采用5000 g(超濾管推薦最大離心力), 稀釋劑選擇0.04% Na2CO3溶液(超濾管推薦Na2CO3溶液濃度應(yīng)≤20%), 取阿莫西林供試液5 mL置超濾管, 依次進(jìn)行離心和溶液稀釋置換處理, 具體見(jiàn)圖 2中路線1。當(dāng)進(jìn)行3次離心超濾后, 供試液中阿莫西林濃度降至0.1 mg·mL-1, 同時(shí)溶劑基本置換為0.04% Na2CO3, 兩者均對(duì)后續(xù)Bradford法測(cè)定不產(chǎn)生干擾, 而此時(shí)溶液中殘留蛋白的含量濃縮了5倍(相當(dāng)于富集500 mg阿莫西林中殘留蛋白的量)。因此, 實(shí)驗(yàn)采用路線1作為供試液超濾前處理方法。

 

3.2 超濾前處理法的準(zhǔn)確性與應(yīng)用探討

實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)不同BSA溶液的回收率考察超濾膜的截留效率。結(jié)果顯示, 對(duì)BSA水溶液進(jìn)行單次離心超濾, 回收率>96%;當(dāng)進(jìn)行3次離心超濾, 回收率>90%, 表明超濾膜對(duì)BSA水溶液的截留效率較高?？紤]堿液和抗生素可能對(duì)超濾膜材質(zhì)產(chǎn)生影響, 進(jìn)而降低截留效率, 實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步考察發(fā)現(xiàn), 當(dāng)采用4% Na2CO3溶液作為溶劑配制BSA溶液時(shí), BSA回收率降低至80%~90%;而B(niǎo)SA在阿莫西林供試液中的加樣回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示, 回收率進(jìn)一步降低為70%~80%, 提示Na2CO3和阿莫西林會(huì)對(duì)超濾膜材質(zhì)產(chǎn)生影響, 在一定范圍內(nèi)降低其對(duì)大分子物質(zhì)的截留效率, 離心步驟(次數(shù))越多, 會(huì)導(dǎo)致回收率偏低, 影響超濾提取的準(zhǔn)確性。

 

為進(jìn)一步考察上述實(shí)際影響, 實(shí)驗(yàn)在采用路線1對(duì)樣品進(jìn)行前處理的基礎(chǔ)上, 增加了超濾前處理步驟, 還采用圖 2中路線2同時(shí)平行對(duì)6批樣品的供試液進(jìn)行超濾前處理, 然后分別收集5次離心步驟所得的下層溶液(圖 2中下層溶液1~5), 按"2.3"節(jié)下方法測(cè)定各溶液吸光度值, 結(jié)果顯示, 隨著超濾不斷進(jìn)行, 下層溶液的吸光度曲線不斷降低, 當(dāng)經(jīng)過(guò)第三次離心超濾前處理后(圖 4A虛線所示), 下層溶液3的吸光度值基本與空白稀釋劑(0.04% Na2CO3)的吸光度值一致; 隨著超濾進(jìn)一步進(jìn)行, 后續(xù)步驟下層溶液4和5的吸光度曲線與空白稀釋劑吸光度曲線基本平行(圖 4), 提示當(dāng)超濾完成3次離心處理后, 已能達(dá)到溶液凈化、蛋白濃縮的目的。對(duì)2種路線樣品超濾前處理后最終所得上層待測(cè)液進(jìn)行測(cè)定, 結(jié)果顯示, 路線1測(cè)得樣品中殘留蛋白的含量略高于路線2, 表明超濾步驟過(guò)多會(huì)使樣品中蛋白富集產(chǎn)生一定損失, 影響超濾前處理的準(zhǔn)確性。因此, 實(shí)驗(yàn)最終采用路線1 (圖 2)作為超濾前處理?xiàng)l件, 既保證了測(cè)定準(zhǔn)確性, 又提高了實(shí)驗(yàn)效率。

 

圖 4 6批阿莫西林供試液離心下層液吸光度曲線圖

 

相比較于其它前處理方法(如GFC法), 超濾法具有對(duì)儀器要求低、操作簡(jiǎn)便、濃縮富集量大等優(yōu)點(diǎn)。對(duì)于GFC法, 當(dāng)對(duì)200 mg樣品中的殘留蛋白進(jìn)行富集時(shí), 需要進(jìn)樣4次(60 min·次-1·批-1, 上樣量500 µL), 而超濾法一次處理即可同時(shí)實(shí)現(xiàn)對(duì)6批供試品中相當(dāng)于500 mg樣品中的殘留蛋白量進(jìn)行富集, 大大提高了實(shí)驗(yàn)效率。此外, 超濾法得到的濃縮液可直接用于測(cè)定, 無(wú)需經(jīng)凍干、復(fù)溶等步驟處理, 且殘留蛋白不經(jīng)過(guò)液態(tài)-固態(tài)-液態(tài)的形式轉(zhuǎn)變, 不對(duì)蛋白自身結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響。但值得注意的是, 目前市售商品化超濾管基本為水溶性濾膜, 對(duì)含有機(jī)溶劑(或有機(jī)相比例較高)的溶液不耐受, 因此, 超濾法僅適用于水溶性樣品中殘留蛋白的富集。

 

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