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作者：張文娟 , 趙萌 , 項(xiàng)新華 , 魏鋒 , 馬雙成       

中國(guó)食品藥品檢定研究院, 北京 100050 

 

 

 

摘要：目的: 考察相關(guān)實(shí)驗(yàn)室執(zhí)行《中華人民共和國(guó)藥典》川貝母PCR-RFLP法鑒別檢驗(yàn)項(xiàng)目的技術(shù)能力，促進(jìn)分子生物學(xué)技術(shù)在中藥檢定中的廣泛應(yīng)用。方法: 測(cè)試樣品為粉末，對(duì)樣品的均勻性和穩(wěn)定性進(jìn)行評(píng)價(jià)，樣品種類(lèi)分為陽(yáng)性和陰性?xún)煞N，采用隨機(jī)單盲方式分配至參與能力驗(yàn)證的實(shí)驗(yàn)室。各實(shí)驗(yàn)室按照作業(yè)指導(dǎo)書(shū)進(jìn)行檢測(cè)，并以規(guī)定格式書(shū)寫(xiě)原始記錄。檢測(cè)結(jié)果與樣品性質(zhì)一致的實(shí)驗(yàn)室為滿(mǎn)意。對(duì)各實(shí)驗(yàn)室的反饋結(jié)果進(jìn)行匯總和分析。結(jié)果: 最終報(bào)名參加的實(shí)驗(yàn)室總計(jì)50家，能力驗(yàn)證結(jié)果為滿(mǎn)意的26家，占52%，不滿(mǎn)意24家，占48%。其中3家試驗(yàn)室未按要求返回結(jié)果，判定為不滿(mǎn)意。分別統(tǒng)計(jì)不同類(lèi)型參加實(shí)驗(yàn)室的滿(mǎn)意率，地市級(jí)食藥檢機(jī)構(gòu)滿(mǎn)意率最高，為70.6%。結(jié)論: 總體滿(mǎn)意率偏低，川貝母PCR-RFLP法鑒別檢驗(yàn)項(xiàng)目的整體技術(shù)水平有待提高。

關(guān)鍵詞：能力驗(yàn)證    川貝母鑒別    PCR-RFLP    

 

 

 

 

川貝母是我國(guó)傳統(tǒng)大宗中藥材, 具有良好的止咳化痰功效, 在中藥臨床和日常生活中應(yīng)用甚廣[1]。近年來(lái)隨著其市場(chǎng)價(jià)格逐年攀升, 以貝母屬其他品種充當(dāng)川貝母出售的現(xiàn)象亦愈加嚴(yán)重[2-3]。長(zhǎng)期以來(lái), 川貝母的鑒別檢驗(yàn)主要依靠性狀鑒別, 但是, 有些混淆品的外觀性狀與川貝母十分相似, 很難就此作出客觀準(zhǔn)確的判斷。DNA分子鑒定技術(shù)不會(huì)受到藥材外觀性狀變化的影響, 可從DNA水平實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確鑒別, 伴隨著相關(guān)方法的不斷開(kāi)發(fā)和完善, 對(duì)中藥鑒定的影響與日俱增[4-5]。自《中華人民共和國(guó)藥典》(以下簡(jiǎn)稱(chēng)《中國(guó)藥典》)2010年版第一增補(bǔ)本起, 川貝母項(xiàng)下收錄了聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(PCR-RFLP)方法, 用于川貝母鑒別。該方法較傳統(tǒng)性狀鑒別法客觀準(zhǔn)確, 應(yīng)在全國(guó)大力推廣應(yīng)用[6-7]。然而, 由于分子生物學(xué)技術(shù)在中藥檢定中屬于比較新的技術(shù), 在該藥典方法頒布之初, 很多藥檢機(jī)構(gòu)在技術(shù)人員和實(shí)驗(yàn)室設(shè)施等方面條件欠缺, 尚不具備該方法的檢驗(yàn)?zāi)芰?。近年?lái), 中國(guó)食品藥品檢定研究院(以下簡(jiǎn)稱(chēng)中檢院)通過(guò)針對(duì)全國(guó)藥檢系統(tǒng)舉辦培訓(xùn)班、培養(yǎng)地方藥檢所進(jìn)修人員等方式, 為推廣和普及中藥分子鑒定方法做出大量努力。在中檢院的指導(dǎo)和幫助下, 一些藥檢機(jī)構(gòu)建立了中藥分子生物學(xué)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室, 并開(kāi)始承接川貝母PCR-RLFP法鑒別檢驗(yàn)項(xiàng)目, 但是, 這些實(shí)驗(yàn)室在該項(xiàng)目的檢驗(yàn)?zāi)芰ι线€有待評(píng)估。

 

能力驗(yàn)證即利用實(shí)驗(yàn)室間比對(duì), 按照預(yù)先制定的準(zhǔn)則評(píng)價(jià)參加者的能力, 是實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量保證體系中的一個(gè)重要組成部分。國(guó)家認(rèn)可制度中對(duì)實(shí)驗(yàn)室參加能力驗(yàn)證并取得滿(mǎn)意結(jié)果提出了明確的要求[8]。2017年, 中檢院組織了川貝母PCR-RFLP法鑒別檢驗(yàn)?zāi)芰︱?yàn)證項(xiàng)目(NIFDCPT-102), 旨在考察執(zhí)行《中國(guó)藥典》標(biāo)準(zhǔn)相關(guān)實(shí)驗(yàn)室的技術(shù)能力和管理水平, 促進(jìn)分子生物學(xué)技術(shù)在中藥檢定中的廣泛應(yīng)用, 提高檢測(cè)水平, 為全面監(jiān)控中藥材的質(zhì)量提供科學(xué)、可靠的技術(shù)平臺(tái)[9-10]。本文將對(duì)此次能力驗(yàn)證活動(dòng)的情況進(jìn)行總結(jié), 并對(duì)其中發(fā)現(xiàn)的問(wèn)題進(jìn)行解析, 以期為參與能力驗(yàn)證的實(shí)驗(yàn)室提高檢測(cè)能力和改進(jìn)質(zhì)量管理體系提供幫助。

 

1 能力驗(yàn)證方法

 

1.1 檢測(cè)項(xiàng)目和要求

 

檢測(cè)項(xiàng)目為川貝母[鑒別]聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)限制性?xún)?nèi)切酶片段長(zhǎng)度多態(tài)性(PCR-RFLP)法。本實(shí)驗(yàn)方法依據(jù)《中國(guó)藥典》2015年版一部川貝母[鑒別]3要求, 并參照《作業(yè)指導(dǎo)書(shū)》的要求進(jìn)行檢驗(yàn)和報(bào)告結(jié)果。

 

1.2 能力驗(yàn)證樣品描述

 

能力驗(yàn)證樣品為川貝母粉末, 裝于1.5 mL離心管, 20 mg/管。每個(gè)實(shí)驗(yàn)室發(fā)放1管。樣品源自留存的檢驗(yàn)樣品, 分為陰性樣品和陽(yáng)性樣品兩類(lèi), 依據(jù)CNAS GL03:2006《能力驗(yàn)證樣品均勻性和穩(wěn)定性評(píng)價(jià)指南》對(duì)樣品進(jìn)行均勻性和穩(wěn)定性評(píng)價(jià)[11]。檢驗(yàn)合格后, 樣品通過(guò)EMS快遞分發(fā), 每個(gè)實(shí)驗(yàn)室1份, 樣品的類(lèi)型(陰性或陽(yáng)性)為隨機(jī)單盲分配到各個(gè)實(shí)驗(yàn)室。

 

1.3 結(jié)果評(píng)價(jià)原則

 

1.3.1 檢驗(yàn)依據(jù)

 

按照《中國(guó)藥典》2015年版一部川貝母[鑒別]聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性?xún)?nèi)切酶片段長(zhǎng)度多態(tài)性(PCR-RFLP)法的規(guī)定:供試品凝膠電泳圖譜中, 在與對(duì)照藥材凝膠電泳圖譜相應(yīng)的位置上, 在100~250 bp位置應(yīng)有兩條DNA條帶, 空白對(duì)照無(wú)條帶。

 

1.3.2 檢驗(yàn)?zāi)芰υu(píng)定

 

根據(jù)藥典規(guī)定, 陽(yáng)性(合格)樣品的檢測(cè)結(jié)果應(yīng)為供試品凝膠電泳圖譜中, 在與對(duì)照藥材凝膠電泳圖譜相應(yīng)的位置上, 于100~250 bp位置可見(jiàn)兩條DNA條帶, 空白對(duì)照無(wú)條帶。陰性(不合格)樣品的檢測(cè)結(jié)果應(yīng)為供試品凝膠電泳圖譜中, 在與對(duì)照藥材凝膠電泳圖譜相應(yīng)的位置上, 于100~250 bp位置未見(jiàn)兩條DNA條帶, 空白對(duì)照無(wú)條帶。根據(jù)以上要求, 各參加實(shí)驗(yàn)室得出正確的檢驗(yàn)結(jié)論即為滿(mǎn)意, 否則為不滿(mǎn)意。

 

2 結(jié)果

 

2.1 參加實(shí)驗(yàn)室情況

 

本計(jì)劃共有50家實(shí)驗(yàn)室報(bào)名參加, 發(fā)出樣品50份。3家實(shí)驗(yàn)室在收到樣品后告知樣品破損, 給予及時(shí)補(bǔ)寄。另有3家實(shí)驗(yàn)室收樣前未表示退出, 收樣后至今亦未反饋結(jié)果。最終, 本次能力驗(yàn)證項(xiàng)目共47家實(shí)驗(yàn)室按要求提交了結(jié)果報(bào)告單。

 

參加本次能力驗(yàn)證的實(shí)驗(yàn)室分布于全國(guó)20個(gè)省(自治區(qū))、直轄市, 浙江省最多(8家)。實(shí)驗(yàn)室類(lèi)型以各級(jí)食品藥品檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)為主, 其中省級(jí)18家, 占比36%, 地市級(jí)17家, 占比34%;另有第三方檢測(cè)機(jī)構(gòu)12家, 占比24%, 出入境檢驗(yàn)檢疫機(jī)構(gòu)3家, 占比6%。具體實(shí)驗(yàn)室類(lèi)型統(tǒng)計(jì)見(jiàn)圖 1。

  圖 1 參加實(shí)驗(yàn)室的類(lèi)型統(tǒng)計(jì)

 

2.2 樣品均勻性與穩(wěn)定性測(cè)試

 

將所有待發(fā)放川貝母樣品混合均勻打粉, 取3份提取DNA并進(jìn)行PCR-RFLP法檢測(cè)。陰性樣品和陽(yáng)性樣品分別取樣檢測(cè)。3份樣品均得到一致預(yù)期結(jié)果:即陰性樣品皆有條帶擴(kuò)增, 但不能被SmaⅠ酶切; 陽(yáng)性樣品既有條帶擴(kuò)增, 又能被SmaⅠ酶切割成兩個(gè)條帶, 大小在100~250 bp之間。以上結(jié)果表明樣品的均勻性良好。

 

將打粉后的樣品于室溫放置一個(gè)月后, 再次提取DNA并用PCR-RFLP法進(jìn)行檢測(cè), 發(fā)現(xiàn)得到的結(jié)果與一個(gè)月前基本一致。以上結(jié)果表明樣品的穩(wěn)定性良好。具體結(jié)果詳見(jiàn)圖 2、圖 3。

  a.樣品打粉處理后PCR-RFLP結(jié)果；b.樣品打粉處理后室溫放置一個(gè)月PCR-RFLP結(jié)果。B.空白對(duì)照；M. DNA分子量標(biāo)記DL2000；1~3.樣品。

圖 2 陰性樣品均勻性穩(wěn)定性測(cè)試

  

a.樣品打粉處理后PCR-RFLP結(jié)果；b.樣品打粉處理后室溫放置一個(gè)月PCR-RFLP結(jié)果。B.空白對(duì)照；M. DNA分子量標(biāo)記DL2000；1~3.樣品。

圖 3 陽(yáng)性樣品均勻性穩(wěn)定性測(cè)試

 

2.3 參加實(shí)驗(yàn)室能力驗(yàn)證結(jié)果統(tǒng)計(jì)

 

報(bào)名的50家實(shí)驗(yàn)室中, 47家按要求反饋了結(jié)果。另3家實(shí)驗(yàn)室因?yàn)樵谑盏綐悠非拔幢硎就顺? 收到樣品后未反饋結(jié)果, 判定為不滿(mǎn)意[12]。

 

能力驗(yàn)證結(jié)果:滿(mǎn)意26家, 占52%;不滿(mǎn)意24家, 占48%, 見(jiàn)圖 4。對(duì)不同類(lèi)型參加實(shí)驗(yàn)室滿(mǎn)意率分別進(jìn)行統(tǒng)計(jì)的結(jié)果見(jiàn)表 1。

  圖 4 滿(mǎn)意率統(tǒng)計(jì)

  

表 1 Table 1  表 1 不同類(lèi)型檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)滿(mǎn)意率統(tǒng)計(jì)   

 表 1 不同類(lèi)型檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)滿(mǎn)意率統(tǒng)計(jì)

 

3 技術(shù)分析和建議

 

在本次能力驗(yàn)證中, 不滿(mǎn)意的技術(shù)原因主要?dú)w結(jié)為以下三方面:

 

3.1 PCR擴(kuò)增結(jié)果陰性

 

不論陰性還是陽(yáng)性樣品, 都應(yīng)有PCR擴(kuò)增的條帶出現(xiàn)。PCR擴(kuò)增結(jié)果陰性, 說(shuō)明參加單位在DNA提取或者PCR試驗(yàn)操作中存在不足, 需要通過(guò)規(guī)范化的練習(xí)提高這方面的試驗(yàn)技能。大多數(shù)未通過(guò)能力驗(yàn)證的實(shí)驗(yàn)室都屬于這種情況, 說(shuō)明該方面的問(wèn)題具有普遍性。

 

3.2 陽(yáng)性樣品有擴(kuò)增條帶但酶切失敗

 

理論上, 陽(yáng)性樣品應(yīng)有擴(kuò)增條帶且酶切成功, 凝膠電泳圖譜可見(jiàn)兩條酶切后的條帶。酶切試驗(yàn)的影響因素較少, 可控性好, 試驗(yàn)結(jié)果穩(wěn)定, 一般不容易在此步驟出現(xiàn)問(wèn)題。而少數(shù)幾家實(shí)驗(yàn)室結(jié)果顯示, 對(duì)照藥材可酶切, 樣品不能酶切, 由于對(duì)照藥材與樣品應(yīng)為同時(shí)操作, 理論上不應(yīng)出現(xiàn)此種情況。相關(guān)單位在今后試驗(yàn)中應(yīng)該特別注意將對(duì)照與樣品的平行操作貫穿始終。

 

3.3 結(jié)果正確, 結(jié)論錯(cuò)誤

 

個(gè)別實(shí)驗(yàn)室的原始記錄顯示得到了正確結(jié)果, 但最后結(jié)論中對(duì)結(jié)果的判斷有誤。例如結(jié)果出現(xiàn)了陽(yáng)性酶切條帶, 但被描述為"隱約可見(jiàn)例", 最后結(jié)論判定為"不符合規(guī)定"。出現(xiàn)此種情況, 提示實(shí)驗(yàn)人員對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的理解存在偏差。定性試驗(yàn)中不應(yīng)出現(xiàn)含糊的用詞, 實(shí)驗(yàn)者應(yīng)通過(guò)重復(fù)試驗(yàn)確定究竟"可見(jiàn)"或"未見(jiàn)", 最終得到明確結(jié)果和正確判斷。

 

4 結(jié)論

 

本次能力驗(yàn)證活動(dòng)中, 總體滿(mǎn)意率僅為52%, 與其他能力驗(yàn)證項(xiàng)目相比, 滿(mǎn)意率偏低, 說(shuō)明對(duì)于這個(gè)檢測(cè)項(xiàng)目而言, 普遍的檢測(cè)水平有待提高。特別是省級(jí)藥檢機(jī)構(gòu)的滿(mǎn)意率要低于市級(jí), 這種情況在一般的能力驗(yàn)證活動(dòng)中并不多見(jiàn), 強(qiáng)烈提示省級(jí)藥檢機(jī)構(gòu)應(yīng)在今后特別注意加強(qiáng)中藥分子鑒定技術(shù)相關(guān)檢驗(yàn)檢測(cè)能力的訓(xùn)練和儲(chǔ)備。一次能力驗(yàn)證的結(jié)果只能證明實(shí)驗(yàn)室參加本次能力驗(yàn)證活動(dòng)的情況, 不能全面體現(xiàn)實(shí)驗(yàn)室的檢測(cè)水平。只有持續(xù)參加同一項(xiàng)目的能力驗(yàn)證活動(dòng), 其總體結(jié)果才能反映實(shí)驗(yàn)室的能力狀況[13]。此外, 未能通過(guò)此次能力驗(yàn)證的實(shí)驗(yàn)室, 還可以通過(guò)這個(gè)項(xiàng)目后續(xù)的測(cè)量審核活動(dòng)重新評(píng)估檢測(cè)能力。本次能力驗(yàn)證活動(dòng)為各實(shí)驗(yàn)室提供了一個(gè)衡量和驗(yàn)證自我檢測(cè)能力的平臺(tái), 同時(shí)也為政府管理部門(mén)和社會(huì)委托檢驗(yàn)提供可靠的選擇依據(jù), 并對(duì)促進(jìn)參加實(shí)驗(yàn)室提高川貝母PCR-RFLP鑒別檢驗(yàn)?zāi)芰ζ鸬椒e極的推動(dòng)作用。

 

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