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嘉峪檢測網(wǎng) 2020-03-06 14:55
摘要：
伴隨大量創(chuàng)新及仿制藥面世而來的是對遺傳毒性雜質(zhì)加強(qiáng)監(jiān)管的迫切需求。一系列與國際接軌的指南性文件的出臺(tái)，彌補(bǔ)了我國雜質(zhì)監(jiān)管的空白，但難點(diǎn)尚存。傳統(tǒng)評價(jià)方法具有局限性，新方法與傳統(tǒng)方法間缺乏一致性比較，藥物特定合成路線實(shí)際產(chǎn)生的大量含警示結(jié)構(gòu)雜質(zhì)缺乏毒理學(xué)評價(jià)數(shù)據(jù)支持，毒性預(yù)測軟件的預(yù)測效力不足等。本文就國內(nèi)外雜質(zhì)遺傳毒性雜質(zhì)監(jiān)管科學(xué)現(xiàn)狀、遺傳毒性雜質(zhì)控制策略、雜質(zhì)遺傳毒性評價(jià)方法進(jìn)行論述，并提出充分結(jié)合計(jì)算機(jī)毒理學(xué)、毒性評價(jià)方法和符合我國國情的監(jiān)管限度制定三個(gè)維度開展雜質(zhì)監(jiān)管工作。
關(guān)鍵詞：雜質(zhì) 遺傳毒性 評價(jià)方法 警示結(jié)構(gòu) 細(xì)菌回復(fù)突變試驗(yàn) Pig-a基因突變試驗(yàn)
2018年7月6日，浙江華海藥業(yè)公布其抗高血壓藥物纈沙坦的原料藥中發(fā)現(xiàn)遺傳毒性雜質(zhì)(Genotoxicity Impurity)N-亞硝基二甲胺(N-nitrosodimethylamine，NDMA)的含量超過限值。NDMA作為N-亞硝胺類化合物，被國際癌癥研究機(jī)構(gòu)(International Agency for Research on Cancer，IARC)列為2A類致癌物，少量攝取即存在誘發(fā)腫瘤的風(fēng)險(xiǎn)。2018年7月23日，華海藥業(yè)迅速完成國內(nèi)纈沙坦原料藥的召回。2018年7月29日，原國家食品藥品監(jiān)督管理總局新聞發(fā)言人對華海藥業(yè)NDMA雜質(zhì)事件作情況說明。2018年8月17日，國家藥典委員會(huì)對纈沙坦的國家標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行修訂并指出必須對生產(chǎn)工藝進(jìn)行評估以確定形成N-亞硝基二甲胺的可能性。此事在國內(nèi)引起軒然大波，并再次喚醒公眾對遺傳毒性雜質(zhì)監(jiān)管的重視。在事件的持續(xù)發(fā)酵過程中，華海藥業(yè)股價(jià)連續(xù)跌停，年度凈利潤下滑78.4%，累計(jì)計(jì)提損失超過4億元。華海藥業(yè)并非第一家涉及遺傳毒性雜質(zhì)管控事故的廠家，也絕非最后一個(gè)。2007年，歐洲藥品管理局(European Medicines Agency，EMA)發(fā)現(xiàn)抗艾滋病藥物Viracept中含有的遺傳毒性雜質(zhì)甲磺酸乙酯(Ethyl Methanesulfonate，EMS)超出限定值，從歐洲市場召回[1]。2019年6月，美國麥克勞德制藥(Macleods Pharmaceuticals)生產(chǎn)的2批次氯沙坦鉀片和30批次的氯沙坦鉀/氫氯噻嗪片也因檢出超量NDMA而自愿從市場召回[2]。一系列藥品召回事件造成惡劣社會(huì)影響，并不斷敲響藥物雜質(zhì)毒性監(jiān)管的警鐘。
1 國內(nèi)外遺傳毒性雜質(zhì)監(jiān)管現(xiàn)狀
藥品在生產(chǎn)合成和貯運(yùn)過程中可能引入對人體有害的雜質(zhì)，其中一部分具有遺傳毒性風(fēng)險(xiǎn)的成為遺傳毒性雜質(zhì)。后者在很低濃度下即可誘導(dǎo)基因突變和染色體損傷，甚至導(dǎo)致癌癥并危及生命[3]。遺傳毒性雜質(zhì)本質(zhì)上是藥物生產(chǎn)或保存過程中難以避免，甚至不可避免的產(chǎn)物。制藥企業(yè)在藥物研發(fā)過程中，通常需花費(fèi)大量時(shí)間和財(cái)力來驗(yàn)證合成過程中不存在有遺傳毒性風(fēng)險(xiǎn)的產(chǎn)物。遺傳毒性雜質(zhì)的出現(xiàn)也對監(jiān)管機(jī)構(gòu)提出了新的要求和挑戰(zhàn)。然而，遺傳毒性雜質(zhì)的監(jiān)管起步較晚，自2000年以后才陸續(xù)受到各國的重視。近年來，歐盟、美國藥品監(jiān)管機(jī)構(gòu)相繼發(fā)布了遺傳毒性和致癌性雜質(zhì)的指導(dǎo)原則。如EMA人用藥委員會(huì)安全工作組(Committees for Human Medicinal Products，CHMP)于2004年發(fā)布《遺傳毒性雜質(zhì)限度指南》并首次提出毒理學(xué)相關(guān)閾值(Threshold of Toxicological Concern，TTC)限度的概念[4]；美國食品藥品監(jiān)督管理局(Food and Drug Administration，F(xiàn)DA)于2006年發(fā)布《原料藥和成品藥中遺傳毒性和致癌性雜質(zhì)推薦方法》并提出使用決策樹(Decision Tree)法對雜質(zhì)風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行評估[5]；人用藥品注冊技術(shù)要求國際協(xié)調(diào)會(huì)(International Council for Harmonization of Technical Requirement for Pharmaceuticals for Human Use，ICH)在2017年發(fā)布的ICH M7指導(dǎo)原則中為遺傳毒性雜質(zhì)的確認(rèn)、研究和控制方法提供了指導(dǎo)性的建議和技術(shù)要求[6]。ICH M7的頒布具有里程碑式的意義，它將取代EMA遺傳毒性雜質(zhì)限度指南和美國FDA遺傳毒性雜質(zhì)指南草案，成為今后國際上廣泛通行的遺傳毒性雜質(zhì)控制指導(dǎo)性文件。原國家食品藥品監(jiān)督管理局于2017年成為ICH正式成員，我國相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)和指導(dǎo)原則已與國際接軌。《中華人民共和國藥典》 (以下簡稱《中國藥典》)2015年版四部中已收載了《藥品雜質(zhì)分析指導(dǎo)原則》，國家藥典委員會(huì)于2019年及時(shí)發(fā)布了《遺傳毒性雜質(zhì)控制指導(dǎo)原則》 (征求意見稿) [7]，當(dāng)前，國家藥品監(jiān)督管理局正在推進(jìn)ICH M7在我國的落地與轉(zhuǎn)化。一系列指南性文件的出臺(tái)彌補(bǔ)了我國與先進(jìn)國家和組織之間的貿(mào)易與技術(shù)壁壘。
2 遺傳毒性雜質(zhì)控制策略
致癌性風(fēng)險(xiǎn)在藥物研發(fā)階段即受到高度重視，通常會(huì)在研發(fā)早期開展基因突變遺傳毒性標(biāo)準(zhǔn)組合試驗(yàn)對其致癌風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行評估，而有潛在風(fēng)險(xiǎn)的化合物則及早停止研發(fā)。雜質(zhì)因其特性有可能無法從藥物中去除，故根據(jù)人體暴露情況設(shè)置定量限成為可行的監(jiān)管方略。EMA于2006年首先在遺傳毒性雜質(zhì)監(jiān)管中引入化學(xué)物質(zhì)慢性毒性研究的毒理學(xué)相關(guān)閾值概念，在700余種致癌物分析基礎(chǔ)上，提出以1.5μg·d-1為有潛在遺傳毒性風(fēng)險(xiǎn)的化合物的TTC[8]。該暴露水平下，人體終生服用該物質(zhì)的患癌可能性為十萬分之一。美國藥品研究和制造商協(xié)會(huì)(The Pharmaceutical Research and Manufacturers of America，PhRMA)進(jìn)一步對建立暴露時(shí)間與TTC之間的關(guān)聯(lián)，建立“分期TTC [9]”。此外，PhRMA率先提出了雜質(zhì)遺傳毒性五分類的概念，并以構(gòu)效關(guān)系(Structure-activity Relationship，SAR)為分類依據(jù)，根據(jù)警示結(jié)構(gòu)預(yù)測其誘導(dǎo)人體腫瘤的風(fēng)險(xiǎn)[9]。從而將化合物結(jié)構(gòu)作為堿基插入導(dǎo)致的突變和腫瘤形成的重要決策基礎(chǔ)，而評估堿基突變風(fēng)險(xiǎn)的試驗(yàn)方法也在分類中有重要權(quán)重。“分期TTC”和五分類決策樹的概念對全球藥品雜質(zhì)監(jiān)管影響深遠(yuǎn)，美國FDA的《遺傳毒性雜質(zhì)指南草案：原料藥和成品藥中遺傳毒性和致癌性雜質(zhì)》、ICH M7及我國的《遺傳毒性雜質(zhì)控制指導(dǎo)原則》相繼沿襲，是當(dāng)前雜質(zhì)監(jiān)管領(lǐng)域的主要思路。值得注意的是“分期TCC”的具體限量在不同指南及法規(guī)中有所不同，如表 1所示，我國則以ICH M7為制定監(jiān)管標(biāo)準(zhǔn)的重要依據(jù)。本文以ICH M7為藍(lán)本就雜質(zhì)監(jiān)管要求作簡要介紹。
表 1 不同指南及法規(guī)關(guān)于單個(gè)雜質(zhì)服用時(shí)間與TTC限量對比
ICH M7主要適用于DNA反應(yīng)活性雜質(zhì)，即在含量很低時(shí)便存在致堿基突變及誘發(fā)人體腫瘤的風(fēng)險(xiǎn)。遺傳毒性雜質(zhì)毒性的確認(rèn)及定量構(gòu)效關(guān)系(Quantitative Structure-activity Relationship，QSAR)數(shù)據(jù)庫的構(gòu)建均以毒性研究數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)。根據(jù)致突變和致癌風(fēng)險(xiǎn)危害程度，ICH M7將所有雜質(zhì)歸為5類并提出相關(guān)控制策略[6]。1類雜質(zhì)：已知具有致突變性的致癌物。對于該類雜質(zhì)，首先考慮去除雜質(zhì)，如果無法去除，則應(yīng)建立基于未觀察到作用水平(No Observed Effect Level，NOEL)致癌性數(shù)據(jù)的限度數(shù)值。2類雜質(zhì)：致癌性未知的已知致突變物。如存在閾值相關(guān)機(jī)制，以每日允許暴露量(Permitted Daily Exposure，PDE)求限度值；如無閾值相關(guān)機(jī)制的證據(jù)，根據(jù)TTC確立限度。3類雜質(zhì)：含警示結(jié)構(gòu)、與原料藥結(jié)構(gòu)無關(guān)且無致突變性數(shù)據(jù)的物質(zhì)。根據(jù)TTC確定限度值，或根據(jù)致突變性試驗(yàn)評價(jià)結(jié)果歸為2類雜質(zhì)或5類雜質(zhì)并作相應(yīng)控制。4類雜質(zhì)：含警示結(jié)構(gòu)、與原料藥或原料藥相關(guān)物質(zhì)的警示結(jié)構(gòu)相同，且經(jīng)測試認(rèn)為無致突變性的物質(zhì)；按5類雜質(zhì)(普通雜質(zhì))控制。5類雜質(zhì)：無警示結(jié)構(gòu)，或有充分的數(shù)據(jù)證明警示結(jié)構(gòu)無致突變性或致癌性的物質(zhì)。按普通雜質(zhì)控制。
判斷某個(gè)雜質(zhì)是否屬于遺傳毒性雜質(zhì)時(shí)，首先應(yīng)收集其相關(guān)細(xì)菌回復(fù)突變試驗(yàn)、動(dòng)物和人體致癌性數(shù)據(jù)。部分公開致癌性數(shù)據(jù)庫[10]如表 2所示。
表 2 常用化合物致癌性數(shù)據(jù)庫信息
2.1 已有致癌性或致突變性試驗(yàn)數(shù)據(jù)的雜質(zhì)控制
雜質(zhì)具有已知致突變性或致癌性數(shù)據(jù)歸為1類致癌物，根據(jù)半數(shù)致癌劑量(MedianToxic Dose，TD50)線性外推法對其進(jìn)行控制，即以誘導(dǎo)50%腫瘤發(fā)生率的劑量的五萬分之一為攝入量，可將腫瘤的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)控制于十萬分之一。致癌性強(qiáng)度數(shù)據(jù)庫(Carcinogenicity Potency Database，CPDB)中已明確列出1547種致癌物的TD50值供公開查詢。在測定TD50時(shí)，應(yīng)以單一動(dòng)物種屬和單一性別特定器官的最低TD50為準(zhǔn)。無致癌性試驗(yàn)數(shù)據(jù)的物質(zhì)，歸為第2類或第3類的雜質(zhì)，服用時(shí)間超過10年的藥物，單一雜質(zhì)的攝入量為1.5 μg·d-1，可以應(yīng)用TTC作為大多數(shù)毒性化合物作為可接受攝入量的默認(rèn)值[11]。如原料藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中存在兩個(gè)2類或3類雜質(zhì)，應(yīng)制定各自限度值；如果含3種或更多的2類或3類雜質(zhì)，可按多個(gè)雜質(zhì)的總可被接受攝入量(服用時(shí)間超過10年的藥物雜質(zhì)5 μg·d-1)計(jì)算(如表 2)。值得注意的是，1類雜質(zhì)和制劑中形成的降解產(chǎn)物應(yīng)單獨(dú)控制，不計(jì)入2類和3類雜質(zhì)的總限度值。黃曲霉素類物質(zhì)、N-亞硝基化合物和偶氮類等強(qiáng)致突變性化合物屬于關(guān)注隊(duì)列(Cohort of Concern，COC) [6]，TTC法對該類化合物不適用，其TD50應(yīng)低于1.25 mg·(kg·d) -1。某些DNA反應(yīng)性化合物可能受到某種代謝或調(diào)控通路影響，其實(shí)際閾值或攝入量與致癌性呈非線性關(guān)系，如乙基甲烷磺酸鹽、過氧化氫、苯胺類化合物等，可使用NOEL或PDE[計(jì)算公式：(NOEL×體質(zhì)量)/(動(dòng)物與人用劑量差異系數(shù)×不同人體之間差異×研究時(shí)間系數(shù)×嚴(yán)重情況系數(shù)×觀察到反應(yīng)的最低劑量)]確定限量值(如表 3所示) [6]。
表 3 ICH M7中TTC法控制遺傳毒性雜質(zhì)限度[6]
2.2 無已知致突變性及致癌性試驗(yàn)數(shù)據(jù)的雜質(zhì)控制
絕大多數(shù)雜質(zhì)缺乏充分的遺傳毒性和致癌性研究數(shù)據(jù)，往往難以歸類。遺傳毒性的“警示結(jié)構(gòu)”指雜質(zhì)中的某些特殊基團(tuán)或亞單位可與遺傳物質(zhì)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，從而導(dǎo)致基因突變或染色體重排/斷裂，具有潛在致癌風(fēng)險(xiǎn)。而產(chǎn)生遺傳毒性致癌性的化合物，從作用機(jī)制上分析均具有DNA反應(yīng)活性，通過與遺傳物質(zhì)發(fā)生化學(xué)鍵合引起遺傳信息改變產(chǎn)生致癌性，而基因突變往往是遺傳毒性致癌性作用的起始環(huán)節(jié)[12-13]。Ashby和Benigni等根據(jù)高DNA反應(yīng)活性可以認(rèn)為是堿基突變及腫瘤形成最初階段的原理，歸納并提出了18種化學(xué)結(jié)構(gòu)的“警示結(jié)構(gòu)(Alert Structure)”模型，包括酰鹵、烷基或苯基磺酸酯、烷基或苯基磷酸酯、N-羥甲基衍生物、單鹵代烯烴、硫芥、氮芥等[14]，如圖 1所示。隨后，在國際上提出采用“警示結(jié)構(gòu)”作為區(qū)分普通雜質(zhì)和遺傳毒性雜質(zhì)的重要依據(jù)的概念。這一概念已廣泛應(yīng)用于遺傳毒性和致癌性預(yù)測軟件，也成為遺傳毒性警示結(jié)構(gòu)以及QSAR模型的基礎(chǔ)。對于存在“警示結(jié)構(gòu)”的雜質(zhì)進(jìn)行QSAR預(yù)測和體內(nèi)外相關(guān)研究，或?qū)⑵浜靠刂圃谝欢ǚ秶畠?nèi)。當(dāng)前已有多種計(jì)算機(jī)軟件可對化合物的遺傳毒性進(jìn)行預(yù)測，如基于文獻(xiàn)報(bào)道和專家知識(shí)的預(yù)測軟件Toxtree(Joint Research Centre of European Chemical Bureau)、Derek Nexus(Lhasa Limited)和基于統(tǒng)計(jì)學(xué)的預(yù)測軟件如Sarah Nexus(Lhasa Limited)和CASE Ultra(MultiCase Inc.)等。這些預(yù)測決策樹或根據(jù)既往Ames試驗(yàn)或微核試驗(yàn)等遺傳毒性試驗(yàn)數(shù)據(jù)，或根據(jù)警示結(jié)構(gòu)的遺傳毒性陽性可能性來生成判斷結(jié)果。
圖 1 含有多種“警示結(jié)構(gòu)”的超級致癌物的提出[12]
然而，現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫在預(yù)測效力上存在一定局限性。新藥研發(fā)催生大量新型有效藥物成分(Act ive Pharmaceutical Ingredient，API)和新型合成路線的誕生，現(xiàn)有的數(shù)據(jù)庫信息與浩如煙海的雜質(zhì)種類相比乃九牛之一毛。一項(xiàng)針對十余家跨國藥企百余種合成路線產(chǎn)生的雜質(zhì)的研究中共發(fā)現(xiàn)600多種警示結(jié)構(gòu)，其中烷化劑、芳香胺、酰胺類及芳香硝基衍生物類警示結(jié)構(gòu)占總警示結(jié)構(gòu)的61.3%[15]。值得關(guān)注的是含酰氯衍生物、烷基醛及硼酸類警示結(jié)構(gòu)的化合物在該研究中占總警示結(jié)構(gòu)的5.8%、4.7%和3.5%，但在已知致癌信息數(shù)據(jù)庫中僅占0.5%、0%和0%。故上述警示結(jié)構(gòu)的化合物的致癌性有必要進(jìn)行試驗(yàn)研究。此外，含有“警示結(jié)構(gòu)”的化合物并非一定具有遺傳毒性。以常用解熱鎮(zhèn)痛藥對乙酰氨基酚(4-Acetamidophenol/N-acetylp-aminophenol，APAP)為例，2011年國家藥品抽檢的APAP藥品中含有多種苯酚類雜質(zhì)，基于決策樹的毒性預(yù)測平臺(tái)Toxtree預(yù)測其中絕大多數(shù)含有遺傳毒性致癌性警示結(jié)構(gòu)、多數(shù)含Ames致突變性試驗(yàn)陽性警示結(jié)構(gòu)和體內(nèi)微核試驗(yàn)陽性警示結(jié)構(gòu)，如表 4所示。然而，實(shí)際臨床及動(dòng)物長期研究數(shù)據(jù)并不提示APAP存在致癌性。再以ICH M7推薦使用的毒理學(xué)數(shù)據(jù)庫Derek Nexus為例，其對截至2005年已有206種化合物的預(yù)測結(jié)果的一致性為86%，靈敏性為73%；而對2005-2011年間新增的化合物的預(yù)測度的一致性為89%，靈敏度降低至50%[16-17]。比如，Derek Nexus對4-氯乙酰基乙酰苯胺的致突變性預(yù)測結(jié)果為陰性，然而在多個(gè)實(shí)驗(yàn)室共同開展Ames試驗(yàn)聯(lián)合驗(yàn)證工作中均得到明確陽性結(jié)果[18]。預(yù)測靈敏度的降低提示存在致突變風(fēng)險(xiǎn)的化合物無法通過軟件預(yù)測的方法獲知，監(jiān)管工作中僅憑借構(gòu)效分析軟件預(yù)測結(jié)果仍然存在風(fēng)險(xiǎn)。此外，某些創(chuàng)新藥的化學(xué)結(jié)構(gòu)可能難以通過數(shù)據(jù)庫進(jìn)行預(yù)測。無論基于經(jīng)驗(yàn)或統(tǒng)計(jì)學(xué)的數(shù)據(jù)庫的構(gòu)建，其預(yù)測結(jié)果的準(zhǔn)確度都極大程度上依賴于真實(shí)的試驗(yàn)數(shù)據(jù)?？梢婇_展試驗(yàn)研究對雜質(zhì)毒性評價(jià)具有重要價(jià)值。
表 4 Toxtree對乙酰氨基酚及其雜質(zhì)遺傳毒性預(yù)測結(jié)果
3 藥物雜質(zhì)致突變性評價(jià)方法
由遺傳毒性發(fā)生的機(jī)理可知，基因突變是腫瘤發(fā)生的分子基礎(chǔ)。以堿基突變?yōu)樵u價(jià)終點(diǎn)的Ames試驗(yàn)和體內(nèi)Pig-a基因突變試驗(yàn)，均作為雜質(zhì)遺傳毒性風(fēng)險(xiǎn)評價(jià)的首選試驗(yàn)方法[6]，其試驗(yàn)數(shù)據(jù)已獲得FDA認(rèn)可。評價(jià)受試物與DNA作用風(fēng)險(xiǎn)的彗星試驗(yàn)結(jié)果對雜質(zhì)遺傳毒性評價(jià)也有一定參考。雜質(zhì)毒性評價(jià)的另一大難題，是可合成或獲取的雜質(zhì)量難以滿足試驗(yàn)需要，而ICH M7要求盡量使用雜質(zhì)純品開展評價(jià)；此外，單一化合物可能有10~20余種雜質(zhì)。受試物需求量少、試驗(yàn)周期短的快速評價(jià)方法才能滿足大量雜質(zhì)遺傳毒性評價(jià)的迫切需求，故有必要優(yōu)化和改進(jìn)傳統(tǒng)遺傳毒性評價(jià)方法。
3.1 Ames試驗(yàn)
細(xì)菌回復(fù)突變試驗(yàn)(Bacterial Reverse Mutation Test，Ames)，1970年由Bruce. N. Ames[19]使用組氨酸營養(yǎng)缺陷型鼠傷寒沙門氏菌株(S.Typhimurium)建立，故命名為Ames試驗(yàn)。該試驗(yàn)利用缺乏合成組氨酸能力的細(xì)菌在可誘導(dǎo)堿基突變的化合物的作用下可通過發(fā)生回復(fù)突變，從而自行合成組氨酸來形成大量肉眼可見的菌落的原理，通過菌落計(jì)數(shù)來評價(jià)受試物的堿基突變能力。該方法是當(dāng)前所有遺傳毒性評價(jià)方法中對致癌物預(yù)測度最高的試驗(yàn)，Ames試驗(yàn)對大鼠致癌物和恒河猴致癌物的檢出率分別為69.0%和87.5%，也是化合物QSAR構(gòu)效關(guān)系建立的遺傳毒性篩選數(shù)據(jù)庫的重要基礎(chǔ)[20]。
隨著分子生物技術(shù)發(fā)展的飛躍，Ames作為一項(xiàng)經(jīng)典的致突變性篩選方法經(jīng)歷了一系列改良，比如微孔板、液態(tài)培養(yǎng)法或引入含熒光報(bào)告基因等[21-22]。ICH M7認(rèn)可基于標(biāo)準(zhǔn)平皿的Ames試驗(yàn)數(shù)據(jù)。但某些雜質(zhì)合成困難，基于微孔板的Ames試驗(yàn)，如Mini-Ames(6孔板)或Micro-Ames(24孔板)在不改動(dòng)傳統(tǒng)Ames試驗(yàn)原理的條件下可減少雜質(zhì)的用量，極具應(yīng)用潛力。OECD正在對Ames試驗(yàn)指導(dǎo)原則進(jìn)行修訂，并于2018年在國際范圍內(nèi)收集Mini-Ames、Micro-Ames和Ames波動(dòng)試驗(yàn)的背景數(shù)據(jù)，試圖形成標(biāo)準(zhǔn)化的操作流程。然而非標(biāo)準(zhǔn)平皿的Ames試驗(yàn)各家實(shí)驗(yàn)室操作流程差異很大，較難形成統(tǒng)一操作標(biāo)準(zhǔn)，可能對審評工作造成一定難度。開展相關(guān)試驗(yàn)方法與傳統(tǒng)試驗(yàn)方法結(jié)果的一致性比較則有助于數(shù)據(jù)互認(rèn)和評價(jià)效率。筆者完成的Ames與Mini-Ames試驗(yàn)中陰性與陽性對照組回復(fù)突變菌落數(shù)比較如表 5所示。
表 5 標(biāo)準(zhǔn)平皿Ames與Mini-Ames試驗(yàn)回復(fù)突變菌落數(shù)(個(gè)/皿，x±s)
3.2 Pig-a基因突變試驗(yàn)
體內(nèi)Pig-a基因突變試驗(yàn)是近年來在藥物安全性評價(jià)領(lǐng)域日益受到重視的一項(xiàng)藥物致突變性評價(jià)方法。Pig-a基因位于X染色體，該基因突變可導(dǎo)致糖化磷脂酰肌醇(Glycosylphos-phatidyl Inositol，GPI)合成障礙，從而使相關(guān)細(xì)胞GPI錨蛋白(如CD48、CD55、CD59等)缺失。因GPI錨蛋白在不同物種間的生物合成高度保守，且在各類組織細(xì)胞及各類成熟紅細(xì)胞中均有表達(dá)，故試驗(yàn)可使用正常動(dòng)物外周血作為試驗(yàn)系統(tǒng)[23]。Araten等[24]在1999年首次提出Pig-a基因突變試驗(yàn)可用藥物基因突變風(fēng)險(xiǎn)評價(jià)。Dertinger等[25]進(jìn)一步將高通量免疫磁性篩選技術(shù)引入Pig-a基因突變試驗(yàn)，有效提高了統(tǒng)計(jì)功效。該方法當(dāng)前已完成多中心聯(lián)合驗(yàn)證[25-26]，OECD擬于2020年正式發(fā)布相關(guān)指導(dǎo)原則。當(dāng)Ames試驗(yàn)結(jié)果不明確時(shí)，體內(nèi)Pig-a基因突變試驗(yàn)可作為后續(xù)選擇的試驗(yàn)方法，其結(jié)果已獲得美國FDA認(rèn)可。體內(nèi)Pig-a基因突變試驗(yàn)的主要優(yōu)勢在于可檢測弱致突變劑體內(nèi)蓄積后的致突變風(fēng)險(xiǎn)，并獲得受試物對嚙齒類動(dòng)物致癌風(fēng)險(xiǎn)的相關(guān)數(shù)據(jù)。但其缺點(diǎn)也較為突出，即受試物需求量較大，試驗(yàn)周期長，對于合成量較少的雜質(zhì)來說存在一定困難，且不適合大量雜質(zhì)毒性篩選。但體內(nèi)Pig-a基因突變試驗(yàn)尚未經(jīng)過國內(nèi)聯(lián)合驗(yàn)證及推廣，實(shí)際上具有相關(guān)試驗(yàn)?zāi)芰徒?jīng)驗(yàn)的國內(nèi)安全性評價(jià)中心很少。
近年來，國內(nèi)外陸續(xù)開展基于TK6、MCL-5以及L5178Y等哺乳動(dòng)物細(xì)胞系的體外Pig-a基因突變試驗(yàn)建立與驗(yàn)證工作[27-29]。體外Pig-a基因突變試驗(yàn)的優(yōu)點(diǎn)是使用的受試物用量少、試驗(yàn)周期短(一般受試物處理8天后檢測)、不使用動(dòng)物和適于進(jìn)行機(jī)制研究。但是，在安全評價(jià)領(lǐng)域正式使用之前，在細(xì)胞選擇和標(biāo)準(zhǔn)化試驗(yàn)方法的驗(yàn)證等方面還需要開展大量工作。體內(nèi)及體外Pig-a基因突變試驗(yàn)優(yōu)劣對比詳見表 6。
表 6 體內(nèi)及體外Pig-a基因突變試驗(yàn)比較
3.3 彗星試驗(yàn)
Ostling和Johansson[30]于1984年建立彗星實(shí)驗(yàn)(Comet Assay)，也稱為單細(xì)胞凝膠電泳(Single Cell Gel Electrophoresis，SCGE)，可在單細(xì)胞水平上檢測DNA鏈斷裂程度，從而評價(jià)受試物是否與DNA相互作用。該方法利用損傷的DNA與完整的DNA在電泳中遷移速率差異，對存在DNA損傷的細(xì)胞(形成彗星樣結(jié)構(gòu))進(jìn)行區(qū)分。因DNA斷裂多在給藥后短期內(nèi)出現(xiàn)，該方法可靈敏地檢出短時(shí)間內(nèi)出現(xiàn)的DNA損傷。但DNA單鏈斷裂可自行修復(fù)，損傷不一定遺傳給子代細(xì)胞。故彗星試驗(yàn)的結(jié)果可作為參考，用于判斷受試物與DNA堿基作用的可能性，其結(jié)果對雜質(zhì)的遺傳毒性有一定預(yù)測作用。國際肝細(xì)胞彗星試驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室間聯(lián)合驗(yàn)證于2015年完成并發(fā)表[31]，OECD于2014年頒布體內(nèi)彗星試驗(yàn)指導(dǎo)原則[32]。
4 小結(jié)
綜上所述，隨著大量創(chuàng)新藥及仿制藥的出現(xiàn)，迫切需要加強(qiáng)遺傳毒性雜質(zhì)的監(jiān)管。我國已陸續(xù)出臺(tái)了一系列與國際接軌的指南性文件以支持雜質(zhì)的毒性評估，但實(shí)際工作中難點(diǎn)尚存。如傳統(tǒng)方法在雜質(zhì)評價(jià)中存在局限性，指南性文件對雜質(zhì)的遺傳毒性評價(jià)要求不明確，缺乏新方法與傳統(tǒng)方法之間的一致性比較，藥物合成路線實(shí)際產(chǎn)生的大量含警示結(jié)構(gòu)雜質(zhì)無毒理學(xué)研究數(shù)據(jù)支持，基于構(gòu)效分析的毒性預(yù)測軟件的預(yù)測效力不足等。此外，通過對國家藥品抽檢數(shù)據(jù)庫與歐洲藥典分析比對，我國國抽藥品實(shí)際檢出雜質(zhì)與歐洲藥典中所列出的雜質(zhì)類型存在較大差異，其原因可能與藥物合成加工方式不同有關(guān)。我國藥典中對藥品可能存在的雜質(zhì)和具體定量限要求缺乏詳細(xì)明確的界定，而歐洲藥典中的雜質(zhì)毒性及定量限的信息又難以借鑒。上述因素對監(jiān)管人員在藥物化學(xué)、遺傳毒性評價(jià)等多領(lǐng)域的知識(shí)儲(chǔ)備提出了新的挑戰(zhàn)。遺傳毒性雜質(zhì)的監(jiān)管不是紙上談兵，應(yīng)充分結(jié)合計(jì)算機(jī)毒理學(xué)、毒性評價(jià)方法和制定符合我國國情的監(jiān)管限度值，從三個(gè)維度切實(shí)做好雜質(zhì)的控制，從而提高藥物的安全性，保障人民用藥安全。
參考文獻(xiàn)
[1] Pozniak A, Muller L, Salgo M, et al. Elevated Ethyl Methanesulfonate (EMS) in Nelfinavir Mesylate (Viracept®, Roche):Overview[J]. AIDS Res Ther, 2009, 6: 18. DOI:10.1186/1742-6405-6-18
[2] U.S. FOOD & DRUG ADMINISTRATION. FDA Updates and Press Announcements on Angiotensin Ⅱ Receptor Blocker (ARB) Recalls (Valsartan, Losartan, and Irbesartan)[S]. 2019.
[3] Bercu JP, Dobo KL, Gocke E, et al. Overview of Genotoxic Impurities in Pharmaceutical Development[J]. Int J Toxicol, 2009, 28(6): 468-478. DOI:10.1177/1091581809349195
[4] EUROPEAN MEDICINES AGENCY. Guideline on the Limits of Genotoxic Impurities[S]. 2006.
[5] U.S. FOOD & DRUG ADMINISTRATION. Draft Guidance for Industry on Genotoxic and Carcinogenic Impurities in Drug Substances and Products: Recommended Approaches; Availability[S]. 2008.
[6] EUROPEAN MEDICINES AGENCY. ICH Guideline M7(R1) on Assessment and Control of DNA Reactive (mutagenic) Impurities in Pharmaceuticals to Limit Potential Carcinogenic Risk Step 5[S]. 2018.
[7] 國家藥典委員會(huì).遺傳毒性雜質(zhì)控制指導(dǎo)原則(第一次征求意見稿)[S]. 2019.
[8] Kroes R, Renwick A G, Cheeseman M, et al. Structurebased Shresholds of Toxicological Concern (TTC):Guidance for Application to Substances Present at Low Levels in the Diet[J]. Food Chem Toxicol, 2004, 42(1): 65-83. DOI:10.1016/j.fct.2003.08.006
[9] CHMP Safety Working Party. Question & Answers on the CHMP Guideline on the Limits of Genotoxic Impurities[S]. 2009.
[10] Amberg A, Beilke L, Bercu J, et al. Principles and Procedures for Implementation of ICH M7 Recommended (Q) SAR Analyses[J]. Regul Toxicol Pharmacol, 2016, 77: 13-24. DOI:10.1016/j.yrtph.2016.02.004
[11] Munro IC, Ford RA, Kennepohl E, et al. Correlation of Structural Class with No Observed Effect Levels:A Proposal for Establishing a Threshold of Concern[J]. Food Chem Toxicol, 1996, 34(9): 829-867. DOI:10.1016/S0278-6915(96)00049-X
[12] Ashby J. Fundamental Structural Alerts to Potential Carcinogenicity or Noncarcinogenicity[J]. 1985, 7(6): 919-921.
[13] 馬磊, 馬玉楠, 陳震, 等. 遺傳毒性雜質(zhì)的警示結(jié)構(gòu)[J]. 中國新藥雜志, 2014, 23(18): 2106-2111.
[14] Ashby J, Tennant RW. Chemical Structure, Salmonella Mutagenicity and Extent of Carcinogenicity as Indicators of Genotoxic Carcinogenesis among 222 Chemicals Tested in Rodents by the U.S. NCI/NTP[J]. Mutat Res, 1988, 204(1): 17-115.
[15] Galloway SM, Reddy MV, Mcgettigan K, et al. Potentially Mutagenic Impurities:Analysis of Structural Classes and Carcinogenic Potencies of Chemical Intermediates in Pharmaceutical Syntheses Supports Alternative Methods to the Default TTC for Calculating Safe Levels of Impurities[J]. Regul Toxicol Pharmacol, 2013, 66(3): 326-335. DOI:10.1016/j.yrtph.2013.05.005
[16] Hayashi M, Kamata E, Hirose A, et al. In Silico Assessment of Chemical Mutagenesis in Comparison with Results of Salmonellamicrosome Assay on 909 Chemicals[J]. Mutat Res, 2005, 588(2): 129-135. DOI:10.1016/j.mrgentox.2005.09.009
[17] Hillebrecht A, Muster W, Brigo A, et al. Comparative Evaluation of in Silico Systems for Ames Test Mutagenicity Prediction:Scopeand Limitations[J]. Chem Res Toxicol, 2011, 24(6): 843-54. DOI:10.1021/tx2000398
[18] Dunkel VC, Zeiger E, Brusick D, et al. Reproducibility of Microbial Mutagenicity Assays:Ⅱ. Testing of Carcinogens and Noncarcinogens in SalmonellaTyphimurium and Escherichia Coli[J]. Environ Mutagen, 1985, 7 Suppl 5: 1-248.
[19] Mortelmans K, Zeiger E. The Ames Salmonella/Microsome Mutagenicity Assay[J]. Mutat Res, 2000, 455(1): 29-60.
[20] 于仲波, 吳南翔, 金鋒, 等. 1485種化學(xué)物致突變試驗(yàn)和致癌試驗(yàn)結(jié)果一致性比較[J]. 毒理學(xué)雜志, 2007(4): 320-320.
[21] Zwart N, Lamoree M, Houtman C, et al. Development of a Luminescent MutagenicityTest for High-throughput Screening of Aquatic Samples[J]. Toxicol In Vitro, 2018, 46: 350-360. DOI:10.1016/j.tiv.2017.09.005
[22] 文海若, 宋捷, 鄂蕊, 等. 微孔板與標(biāo)準(zhǔn)平皿Ames試驗(yàn)比較研究[J]. 藥物評價(jià)研究, 2019, 42(5): 81-86.
[23] Peruzzi B, Araten DJ, Notaro R, et al. The use of PIG-A as a Sentinel Gene for the Study of the Somatic Mutation Rate and of Mutagenic Agents in Vivo[J]. Mutat Res Rev Mutat Res, 2010, 705(1): 3-10. DOI:10.1016/j.mrrev.2009.12.004
[24] Kawagoe K, Takeda J, Endo Y, et al. Molecular Cloning of Murine Pig-a, a Gene for GPI-Anchor Biosynthesis, and Demonstration of Interspecies Conservation of Its Structure, Function, and Genetic Locus[J]. Genomics, 1994, 23(3): 566-574. DOI:10.1006/geno.1994.1544
[25] Dertinger SD, Phonethepswath S, Weller P, et al. Interlaboratory Pig-a Gene Mutation Assay Trial:Studies of 1, 3-propane Sultone with Immunomagnetic Enrichment of Mutant Erythrocytes[J]. Environ Mol Mutagen, 2011, 52(9): 748-755. DOI:10.1002/em.20671
[26] Gollapudi BB, Lynch AM, Heflich RH, et al. The in Vivo Pig-a Assay:A Report of the International Workshop On Genotoxicity Testing (IWGT) Workgroup[J]. Mutat Res Genet Toxicol Environ Mutagen, 2015, 783: 23-35. DOI:10.1016/j.mrgentox.2014.09.007
[27] Kruger CT, Fischer BM, Armant O. The in Vitro PIG-A Gene MutationAssay:Glycosylphosphatidylinositol (GPI)-related Genotype-to-phenotype Relationship in TK6 Cells[J]. Arch Toxicol, 2016, 90(7): 1729-1736. DOI:10.1007/s00204-016-1707-x
[28] David R, Talbot E, Allen B, et al. The Development of an in Vitro Pig-a Assay in L5178Y Cells[J]. Arch Toxicol, 2018, 92(4): 1609-1623. DOI:10.1007/s00204-018-2157-4
[29] 李若婉, 周長慧, 黃鵬程, 等. 基于TK6細(xì)胞的體外PIG-A基因突變檢測方法的建立[J]. 癌變·畸變·突變, 2019, 31(3): 242-248.
[30] Collins AR. Measuring Oxidative Damage to DNA and its Repair with the Comet Assay[J]. Biochim Biophys Acta, 2014, 1840(2): 794-800. DOI:10.1016/j.bbagen.2013.04.022
[31] Uno Y, Kojima H, Hayashi M. The JaCVAM-organized International Validation Study of the in Vivo Rodent Alkaline Comet Assay[J]. Mutat Res, 2015, 786-788: 45-76. DOI:10.1016/j.mrgentox.2015.04.010
[32] OECD. Guidelines for the Testing of Chemicals No. 489: In Vivo Mammalian Alkaline Comet Assay[S]. 2014.
作者：文海若, 閆明, 王亞楠 1, 王翀 3, 耿興超 1, 朱炯 3, 張河戰(zhàn), 王雪
1. 中國食品藥品檢定研究院 國家藥物安全評價(jià)監(jiān)測中心, 藥物非臨床安全評價(jià)研究北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 北京 100176;
2. 中國藥科大學(xué), 南京 210009;
3. 中國食品藥品檢定研究院技術(shù)監(jiān)督中心, 北京 102629
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