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非臨床研究制劑（也稱為臨床前或非GLP制劑）在藥物的早期開發(fā)中起著關(guān)鍵作用。這種制劑能夠把藥物（原料藥）帶入到試驗動物中進行藥動學(xué)和毒理學(xué)研究。由于這些研究最終會用于支持人的劑量和安全性，因此對了解藥物的濃度、PK/PD、工藝雜質(zhì)和降解雜質(zhì)的安全性數(shù)據(jù)是很重要的。因此，業(yè)內(nèi)人士已開展對能夠準(zhǔn)確檢測和定量藥物活性成分、雜質(zhì)、降解雜質(zhì)的方法進行開發(fā)和驗證。這種方法往往能夠提供穩(wěn)定性的趨勢性結(jié)果，因此稱為穩(wěn)定性指示方法。

研究中使用的所有分析方法都應(yīng)該是符合其使用目的，能夠獲得可靠結(jié)果并沒有顯著偏差的。這些非臨床研究中的分析方法主要在于提供微量雜質(zhì)和降解產(chǎn)物的定量結(jié)果。用于穩(wěn)定性指示方法的開發(fā)與驗證應(yīng)基于此目的進行設(shè)計，保證具有足夠的選擇性、靈敏度。有幾個重要的部分需要考慮：

（1）降解試驗

在非臨床研究中，如果有足夠的時間和樣品，在穩(wěn)定性指示方法的開發(fā)中應(yīng)考慮進行降解試驗研究。通常，在這個階段，藥物的工藝雜質(zhì)已經(jīng)確定，強制降解研究可以為藥物由于化學(xué)或者物理不穩(wěn)定性結(jié)果提供一個多維度的分析。方法開發(fā)中的降解試驗應(yīng)對潛在的氧化、光照、水解雜質(zhì)具有選擇性。需要注意的是降解試驗中產(chǎn)生的降解物在正常貯藏條件也可能或不可能產(chǎn)生。如果降解產(chǎn)物可能引起安全性或毒性問題，在臨床前研究中應(yīng)進行必要研究。

所有的降解試驗可以使用活性成分預(yù)期濃度的儲備液進行。實驗應(yīng)在活性成分的預(yù)期劑量濃度下用原液進行，可以采用確定處方進行配制，如果處方?jīng)]有最終確定，可采用溶液進行。

考慮降解條件，儲備液可以采用乙腈-水和甲醇-水作為溶劑配制，推薦配制質(zhì)控樣品。所有的降解產(chǎn)物的UV光譜應(yīng)采用PDA檢測器測定。如果沒有PDA檢測器，UV/Vis檢測器應(yīng)使用210-220nm的檢測波長，但是此時，是無法獲得峰純度數(shù)據(jù)的。UV光譜應(yīng)與活性成分進行比較，以確定雜質(zhì)、降解產(chǎn)物的相對響應(yīng)是否與主峰一致。例如如果方法的檢測波長為235nm，降解產(chǎn)物在這個波長下沒有吸收，那么這個雜質(zhì)就不會獲得質(zhì)量平衡。任何降解試驗應(yīng)在短期或者不苛刻的條件下進行。

主要降解途徑的敏感性可以通過觀察活性成分的降解程度來獲得。如果出現(xiàn)10%或更少，說明在臨床前制劑中出現(xiàn)的可能性小，如果藥物損失較大，說明在臨床前制劑中出現(xiàn)潛在降解產(chǎn)物的可能性大，應(yīng)該在方法驗證中對降解產(chǎn)物進行分離度和定量考察。確定關(guān)鍵的降解途徑有助于對臨床前處方和貯藏條件進行確定。以下為幾個常見的降解試驗設(shè)計：

自由基氧化可以使用偶氮二異丁腈（Azobisisobutyronitrile，AIBN）來進行研究。取約10mg的AIBN，加入到盛有10ml儲備液的20ml量瓶中，在40℃下反應(yīng)1-3天。

親核氧化反應(yīng)可以通過在儲備液中或處方中加入稀過氧化氫溶液，在室溫下反應(yīng)24h進行?？赡墚a(chǎn)生N-氧化物或亞砜雜質(zhì)。

酸水解可以通過在儲備液中或處方中加入稀鹽酸溶液進行。降解溶液可以在室溫或60℃條件下放置3天。同理，堿水解可以通過稀氫氧化鈉溶液以相同方式獲得。二者可采用相應(yīng)的酸堿稀溶液進行中和。

光降解試驗可以采用乙腈/水或甲醇/水儲備液或計劃處方，在ICH規(guī)定光照箱中進行10w/m2的20h試驗。

熱降解試驗可以采用儲備液在高溫下進行，典型條件是在60°C 進行24–48 h, 基于貯藏條件，其他室溫以上的條件也可以采用。

質(zhì)量平衡應(yīng)進行考慮，有很多因素會導(dǎo)致質(zhì)量不平衡，如：降解產(chǎn)物沒有發(fā)射團、在死體積時洗脫下來、極性太大、或由于疏水性強，特別是如果形成了二聚體或加合物，而沒有在梯度條件下被洗脫下來。

對于非臨床分析，通常認(rèn)為所有的雜質(zhì)具有相同的響應(yīng)因子，如果在檢測波長下降解產(chǎn)物的響應(yīng)因子與火活性成分差異較大（超過20%），可能就不會獲得質(zhì)量平衡。如果由于上述原因沒有獲得質(zhì)量平衡，結(jié)果應(yīng)進行記錄，并在后續(xù)開發(fā)階段進行進一步研究。

（2）降解試驗的問題解答

與任何方法開發(fā)項目一樣，實際發(fā)生的事情往往與計劃不同。以下是一些處理問題的方法。

助溶劑：當(dāng)采用乙腈作為助溶劑時，有可能形成甲酸。甲酸與仲胺在溶液中會形成加合物。在這種情況下，當(dāng)進行水解研究時，可以考慮使用其他溶劑，如DMSO。

pH值：當(dāng)使用極端pH值進行降解研究時，如果采用HPLC/UV檢測或發(fā)現(xiàn)峰形較差時，要使注入HPLC的溶液的pH值與流動相的pH值接近。建議流動相或緩沖溶應(yīng)具有更強的離子強度來控制溶液的pH值，以使峰形不受影響。強烈建議在HPLC之前檢查樣品溶液的pH值，一般pH值范圍為2-8對大部分色譜柱是可以接受的，但是應(yīng)關(guān)注廠家的推薦范圍。

混懸液：對于懸浮液制劑樣品，在進行任何分析前必須保證均勻性。通常包括將樣品進行渦旋或強力混合，確保代表性。如果溶液不均一，將會導(dǎo)致雜質(zhì)和降解產(chǎn)物含量測定結(jié)果不準(zhǔn)確。

雜質(zhì)水平：注入HPLC的API濃度應(yīng)足夠高，確保所有相關(guān)雜質(zhì)/降解產(chǎn)物峰能夠出峰并定量。雜質(zhì)/降解產(chǎn)物峰沒有彼此分開的，可以通過調(diào)整流動相組成、pH、柱溫、柱長、梯度斜率進行調(diào)節(jié)。

色譜方法：梯度洗脫優(yōu)于等度，應(yīng)以高比例水相開始，以高有機相比例結(jié)束。注意不要使緩沖液在高比例有機相中出現(xiàn)渾濁。采用UV檢測時，推薦使用盡可能低的波長確保雜質(zhì)/降解產(chǎn)物峰能夠被檢測到。采用API的最大吸收波長可能不會檢測到在這個波長下沒有的降解產(chǎn)物峰。采用PDA檢測器可以檢測峰純度和光譜圖來增加專屬性。推薦使用15cm或以上柱長、≥5µm粒徑的色譜柱來增加HPLC分離度。對于UPLC，應(yīng)使用短的、細(xì)粒徑的色譜柱。色譜柱填料應(yīng)確保對pH和高比例水溶液耐用。C18為常用的色譜柱填料，色譜分離的目標(biāo)是通過使用恰當(dāng)?shù)墓潭ㄏ嗍闺s質(zhì)/降解產(chǎn)物峰分離，色譜柱的選擇對于成功進行方法開發(fā)和驗證至關(guān)重要。

需要注意的事情如下：