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2019年7月，美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）發(fā)布了關(guān)于抗病毒藥物產(chǎn)品提交二代測序數(shù)據(jù)的指南。指南為抗病毒藥物產(chǎn)品向FDA提交二代核苷酸序列分析程序以及支持耐藥性評估數(shù)據(jù)提供了意見。

一、背景信息   

為保護(hù)公共衛(wèi)生、避免出現(xiàn)可能傳染他人并導(dǎo)致不能通過已批準(zhǔn)藥物產(chǎn)品控制疾病暴發(fā)的新型耐藥和交叉耐藥病毒變異體，提供準(zhǔn)確的耐藥性信息勢在必行。

FDA對開發(fā)中的抗病毒藥物產(chǎn)品相關(guān)的耐藥性數(shù)據(jù)進(jìn)行獨立分析，從而確保在新審批的抗病毒藥物產(chǎn)品說明書中對產(chǎn)品耐藥性進(jìn)行表征分析和解釋。此外，F(xiàn)DA要求將宿主靶向基因的核苷酸序列分析數(shù)據(jù)用于多態(tài)性分析，以此確定基于不同種群的等位基因是否對療效有影響。

二、二代數(shù)據(jù)提交要求

FDA要求申請人應(yīng)當(dāng)提交詳細(xì)的方案來描述樣本處理和二代測序技術(shù)（NGS）分析程序。同時每個研究的數(shù)據(jù)應(yīng)提供基于種群測序、適合分析的病毒耐藥性數(shù)據(jù)格式，顯示基線和無效序列，并在氨基酸與參考序列相同時使用空白細(xì)胞。FDA建議申請人在與FDA協(xié)商后，建立耐藥性數(shù)據(jù)集的靈敏度水平，或者提供選擇靈敏度水平的理由。提供顯示每個研究或研究亞組（例如各基因型、各劑量）的主要替換的高水平匯總的表格。

申請人應(yīng)當(dāng)提供：（1）頻率表來報告所有頻率大于或等于1%的與基線不同的氨基酸替換。（2）以fastq格式提供每次序列運行中的所有原始NGS數(shù)據(jù)，拼接的序列比對可以選擇以“.fas”“.ace”“ .sam”或“.bam”格式提交。（3）適當(dāng)?shù)膮⒖夹蛄幸约坝糜谌魏螀⒖急葘Φ男畔?。?）基線或參考共有序列并陳述該序列是如何得出的。（5）對于從頭拼接，以fastq格式提供所有大于200個核苷酸的重疊群。

三、NGS檢測要求

NGS方案中包含以下通用方案設(shè)計元素：（1）受試者、研究時間點和待分析的樣本矩陣的描述；（2）待使用的NGS平臺的描述，包括所有相關(guān)的性能特征；（3）待分析的目標(biāo)基因區(qū)域名稱和大??；（4）通用分析策略（例如：鑒別相對于原型株的改變，比較同一受試者不同時間點的序列）；（5）檢測的覆蓋水平，對于一些病毒載量較低的樣本可能不能在滿足要求的覆蓋水平下產(chǎn)生拼接，申請人應(yīng)當(dāng)鑒別不能達(dá)到該覆蓋水平的樣本；（6）用于鑒別、過濾或處理測序錯誤的方法描述。

獲得可靠測序結(jié)果的關(guān)鍵是模板制備，因此待測序的樣本代表了正在分析的種群，應(yīng)對以下信息進(jìn)行描述：從樣本中提取核酸的方法；從污染背景核酸中純化病毒序列的方法；濃縮病毒核酸的方法，包括每個樣本用于逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）（病毒RNA）或PCR（病毒DNA）反應(yīng)的估算目標(biāo)拷貝數(shù)；變性次級結(jié)構(gòu)的方法；生成雙鏈DNA（dsDNA）的方法（包括引物的描述、純化dsDNA用于測序的方法）；NGS文庫制備的方法等。

四、NGS數(shù)據(jù)分析方法和報告要求

序列數(shù)據(jù)的提交必須包括對用于分析測序數(shù)據(jù)集和原始序列信息分析流程的全面描述，這樣FDA才能進(jìn)行獨立的數(shù)據(jù)分析。報告應(yīng)當(dāng)包括（1）每個序列運行測序的序列總數(shù)，測序序列的質(zhì)量評分，測序序列的平均長度，為降低平臺特異性誤差影響而進(jìn)行的任何誤差評估的描述，以及有關(guān)采用了何種修飾參數(shù)來清除潛在序列誤差或者去除未能滿足任何質(zhì)量或長度閾值的測序序列的信息。（2）用于向關(guān)注序列中添加條形碼序列的方法描述，用于根據(jù)條形碼將測序序列分類的程序，條形碼序列是如何從序列修飾的描述，以及所采取的任何消除潛在交叉條形碼污染的預(yù)防措施的描述。

NGS數(shù)據(jù)分析可采用兩種方法來支持抗病毒藥物產(chǎn)品的開發(fā)：（1）短測序序列與參考序列比對。（2）短測序序列從頭拼接來組裝重疊群。比對測序序列與參考序列并識別變異體。根據(jù)序列比對和變異體識別報告結(jié)果。

五、NGS文件類型和提交程序

Fastq格式的原始NGS數(shù)據(jù)和頻率表應(yīng)當(dāng)按照技術(shù)規(guī)范文檔《采用eCTD傳遞電子申請規(guī)格》中列出的指南，通過安全便攜式硬盤發(fā)送至FDA。便攜式硬盤的內(nèi)容應(yīng)注意：（1）硬盤僅可提交原始NGS數(shù)據(jù)、頻率表和目錄；（2）所有NGS數(shù)據(jù)均應(yīng)當(dāng)以fastq格式提供，其中包括核苷酸序列和質(zhì)量信息；（3）各個時間點每例受試者的NGS序列運行，包括基線和接近觀察到治療失敗的時間點；（5）申請人提供的fastq文件應(yīng)當(dāng)標(biāo)記有唯一的受試者識別碼和時間點；（6）NGS方案、適合分析的耐藥性數(shù)據(jù)集以及任何其他支持信息均應(yīng)當(dāng)通過CDER電子文件途徑提交。

六、結(jié)語

NGS是一種新興技術(shù)，申請人在進(jìn)行基于序列的耐藥性分析時頻繁采用該項技術(shù)。由于該技術(shù)可生成臨床樣本中所有RNA或DNA的核苷酸序列，故NGS檢測在有效區(qū)分病原體變異體的同時，也增加了耐藥性分析過程的復(fù)雜性。與Sanger核苷酸序列分析相比， NGS可提供一個病毒種群中個體病毒的核苷酸序列信息，通常每個樣本能提供數(shù)以百萬計或數(shù)以億計的短序列。由于目前尚無標(biāo)準(zhǔn)化的生物信息分析方法來分析這些大型數(shù)據(jù)集，數(shù)據(jù)的復(fù)雜性為審評員分析和驗證序列信息帶來了挑戰(zhàn)。目前，器審中心尚未收到該類產(chǎn)品的注冊申報，F(xiàn)DA關(guān)于抗病毒藥物產(chǎn)品提交二代測序數(shù)據(jù)的要求為器審中心將來對同類檢測產(chǎn)品進(jìn)行技術(shù)審評起到借鑒作用。

參考文獻(xiàn)：

[1] FDA.Submitting Next GenerationSequencing Data to the Division ofAntiviral Products