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嘉峪檢測網(wǎng) 2020-06-02 11:33
1什么是基因毒性雜質(zhì)
基因毒性雜質(zhì)（或遺傳毒性雜質(zhì)，Genotoxic Impurity ，GTI）是指化合物本身直接或間接損傷細胞DNA，產(chǎn)生基因突變或體內(nèi)誘變，具有致癌可能或者傾向。潛在基因毒性的雜質(zhì)（Potential Genotoxic Impurity ，PGI）從結(jié)構(gòu)上看類似基因毒性雜質(zhì)，有警示性，但未經(jīng)實驗證明的黃曲霉素類、亞硝胺化合物、甲基磺酸酯等化合物均為常見的基因毒性雜質(zhì)，許多化療藥物也具有一定的基因毒性，它們的不良反應(yīng)是由化療藥物對正常細胞的基因毒性所致，如順鉑、卡鉑、氟尿嘧啶等。
2為何著重研究基因毒性雜質(zhì)
基因毒性物質(zhì)特點是在很低濃度時即可造成人體遺傳物質(zhì)的損傷，進而導致基因突變并可能促使腫瘤發(fā)生。因其毒性較強，對用藥的安全性產(chǎn)生了強烈的威脅，近年來也越來越多的出現(xiàn)因為在已上市藥品中發(fā)現(xiàn)痕量的基因毒性雜質(zhì)殘留而發(fā)生大范圍的醫(yī)療事故，被FDA強行召回的案例，給藥廠造成了巨大的經(jīng)濟損失。例如某知名國際制藥巨頭在歐洲市場推出的HIV蛋白酶抑制劑維拉賽特錠（Viracept， mesylate)，2007 年7月，EMA暫停了它在歐洲的所有市場活動，因為在其產(chǎn)品中發(fā)現(xiàn)甲基磺酸乙酯超標，甲基磺酸乙酯是一種經(jīng)典的基因毒性雜質(zhì)，該企業(yè)為此付出了巨大的代價，先內(nèi)部調(diào)查殘留超標的原因，因在儀器設(shè)備清洗時乙醇未被完全清除而殘留下來，與甲基磺酸反應(yīng)形成甲基磺酸乙酯。在被要求解決污染問題后還被要求做毒性研究，以更好的評估對患者的風險。同時有多達25000 名患者暴露于這個已知的遺傳毒性。直到解決了這所有問題后 EMA才恢復了它在歐洲的市場授權(quán)。
近年來各國的法規(guī)機構(gòu)如ICH、FDA、EMA等都對基因毒性雜質(zhì)有了更明確的要求，越來越多的藥企在新藥研發(fā)過程中就著重關(guān)注基因毒性雜質(zhì)的控制和檢測。
3哪些化合物是基因毒性雜質(zhì)
雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)多種多樣，對于絕大多數(shù)的雜質(zhì)而言，往往沒有充分的毒性或致癌研究數(shù)據(jù)，因而難以對其進行歸類。在缺乏安全性數(shù)據(jù)支持的情況下，這些法規(guī)和指導原則采用“警示結(jié)構(gòu)”作為區(qū)分普通雜質(zhì)和基因毒性雜質(zhì)的標志。對于含有警示結(jié)構(gòu)的雜質(zhì)，應(yīng)當進行（Q）SAR預測和體內(nèi)外遺傳毒性和致癌性研究，或者將雜質(zhì)水平控制在毒理學關(guān)注閾（TTC）之下。
目前，一般將致癌物分成兩大類：一類是遺傳毒性致癌物，通過化學鍵合直接破壞遺傳物質(zhì)產(chǎn)生致癌性， 大多數(shù)的化學致癌物具有遺傳毒性； 第二類是非遺傳毒性致癌物， 通常不與發(fā)生化學鍵合作用， 不對產(chǎn)生直接破壞， 而是通過遺傳物質(zhì)外的間接機制引起致癌作用（ 如促進細胞過度增殖等）。
將多個文獻中的警示結(jié)構(gòu)匯總于（見原文PDF）。關(guān)于基因雜質(zhì)警示結(jié)果的具體詳細信息另外可參考歐盟發(fā)布的警示結(jié)構(gòu)《Development of structure alerts for the in vivo micronucleus assay in rodents》。或進入 The Carcinogenic Potency Database (CPDB)，里面有 1547 種致癌物質(zhì)的列表，結(jié)構(gòu)式，CAS 號，作用部位，TTC 值等一系列信息。應(yīng)當注意， 含有警示結(jié)構(gòu)并不意味著該雜質(zhì)一定具有遺傳毒性， 而確認有遺傳毒性的物質(zhì)也不一定會產(chǎn)生致癌作用。雜質(zhì)的理化性質(zhì)和其他結(jié)構(gòu)特點（如相對分子質(zhì)量、親水性、分子對稱性 / 空間位阻、反應(yīng)活性以及生物代謝速率等）會對其毒性產(chǎn)生抑制或調(diào)節(jié)作用。警示結(jié)構(gòu)的重要性在于它提示了可能存在的遺傳毒性和致癌性， 為進一步的雜質(zhì)安全性評價和控制策略的選擇指明方向。
4對基因毒性雜質(zhì)的法規(guī)要求及限度
最初，ICH相繼推出的原料藥雜質(zhì)研究指導原則Q3A（R2）、制劑雜質(zhì)研究指導原則 Q3B（R2），在這些指導原則中提及“對于能夠產(chǎn)生強的藥理活性或毒性的潛在雜質(zhì)，即使其含量低于0.1%，仍然建議進行結(jié)構(gòu)鑒定研究”。在之后的修訂版中，還進一步明確“要關(guān)注原料藥中的潛在遺傳毒性雜質(zhì)”，以及“對于毒性非常強的雜質(zhì)，可能需要制定更低的限度”，但是其中并未明確闡述遺傳毒性雜質(zhì)的研究和控制問題，也未提出具體的研究原則、控制策略和限度要求。
在EMA（歐洲藥物評審組織）推出《遺傳毒性雜質(zhì)限度指導原則》, 引入了可接受風險的攝入量，即毒性物質(zhì)限量，或稱毒理學關(guān)注門檻（TTC，Threshold of Toxicological Concern）這個概念。設(shè)置了限度值 TTC(1.5 µg/day)，即相當于每天攝入1.5 µg的基因毒性雜質(zhì)，被認為對于大多數(shù)藥品來說是可以接受的風險（一生中致癌的風險小于十萬分之一）。按照這個閾值，可以根據(jù)預期的每日攝入量計算出活性藥物中可接受的雜質(zhì)水平。需要指出的是TTC是一個風險管理工具，它采用的是概率的方法。假如有一個基因毒性雜質(zhì)，并且我們對它的毒性大小不太了解，如果它的每日攝入量低于 TTC 值，那么它的致癌風險將不會高于10-5 的概率，TTC不能被理解為絕對無風險的保障。在特定的條件下一些基因毒性雜質(zhì)也可以有較高的閾值。如接觸時間比較短等，這個需要根據(jù)實際情況再進行推算 。最近出臺的ICH M7《Assessment and Control of DNA Reactive (Mutagenic) Impurities in Pharmaceuticals to Limit Potential Carcinogenic Risk》中較為詳盡的闡明了如何使用TTC值，如何設(shè)定質(zhì)量標準。下面就簡要介紹ICH M7指導原則中的內(nèi)容。
已經(jīng)建立的TTC概念，用于界定所有未經(jīng)研究，但具有致癌風險或其它毒性效果的化學品的可接受攝入量?；赥TC的方法一般被認為是非常保守的，因為它們牽涉到從給定的50%腫瘤發(fā)生率（TD50）簡單線性外推到十萬分之一發(fā)生率，且采用的數(shù)據(jù)是來自于最敏感物種和最敏感腫瘤部位的TD50數(shù)據(jù)。在使用TTC評估原料藥和制劑中誘變性雜質(zhì)的可接愛標準時，可以采用1.5 µg/天對應(yīng)于十萬分之一生命時長患癌風險。但有些結(jié)構(gòu)基團被識別為具有較高的效價，因此即使攝入量低于TTC 水平，從理論上來說仍會導致可能的顯著癌癥風險。這類具有較高效價的基團被稱為“關(guān)注隊列”，包括黃曲霉素類、N-亞硝基化合物，以及烷基-氧化偶氮基化合物。基于上述這些原因，應(yīng)進行風險評估來決定是否需要采取進一步行動。根據(jù)誘變性和致癌性，可將雜質(zhì)分為五類，采用不同的控制措施，如下表。
應(yīng)采用（Q）SAR 方法進行計算學毒性評估，預測細菌誘變含量的結(jié)果。要使用兩個相互補充的（Q）SAR 預測方法。一個方法應(yīng)是依據(jù)專家規(guī)則的，另一個方法則應(yīng)該是統(tǒng)計方式的。兩個互補的（Q）SAR 方法（專家規(guī)則和統(tǒng)計學）如果沒有發(fā)現(xiàn)結(jié)構(gòu)警示，則足以得出結(jié)論該雜質(zhì)沒有誘變可能，不需要做進一步的檢測。
在對有關(guān)的警示結(jié)構(gòu)（第3類）進行確認之后，可以采用充分的控制措施，或者對該雜質(zhì)單獨進行細菌誘變測試。如果所得的細菌誘變測試結(jié)果為陰性，則可以推翻基于結(jié)構(gòu)的疑慮，這時不建議進行進一步的基因毒性評估。這些雜質(zhì)應(yīng)被當作非誘變性雜質(zhì)（第5類）。如果細菌誘變測試為陽性，則要進行進一步的危害性分析或采取控制措施（第2類）。
如果一種雜質(zhì)具有與藥用物質(zhì)或相關(guān)化合物具有相似的警示結(jié)構(gòu)（例如，在相同位置和相同化學環(huán)境下具有相同警示結(jié)構(gòu)），且該物料的細菌誘變測試為陰性，則該雜質(zhì)可以被認為是非誘變性的（第4類）。
根據(jù) TTC 計算可接受攝入量時，一個具有誘變性的雜質(zhì)每天每人攝入1.5 µg時其風險被認為是可以忽略的（終生暴露情況下理論的患癌風險小于十萬分之一），可以通用于大部分藥物，作為默認的可接受限度控制標準。該方法一般用于長期治療用藥物中的誘變性雜質(zhì)（>10年），且沒有致癌數(shù)據(jù)時（第2類和3類）。
因基因毒性雜質(zhì)毒性較大，須在工藝過程中對相關(guān)雜質(zhì)進行控制。在ICH M7 中也對工藝控制給出了方法。
第一種方法
在原料藥質(zhì)量標準中加入雜質(zhì)檢測并制訂質(zhì)量標準，利于適當?shù)膬x器分析方法。根據(jù)ICH Q6A，方法1控制方式可以適用定期檢測。如果原料藥中的誘變性雜質(zhì)在至少6個連續(xù)的中試批次或3 個連續(xù)的生產(chǎn)批次中，測得結(jié)果均低于可接受限度的30%，則可以論述進行定期檢測。如果不滿足該條件，則建議對原料藥進行常規(guī)檢測。
第二種方法
在原料、起始物料或中間體的質(zhì)量標準中包括對雜質(zhì)的檢測，或作為中控檢測，同時制訂可接受標準，或采用適當?shù)姆治龇椒?，將雜質(zhì)控制在可接受限度以下。
第三種方法
在原料、起始物料或中間體的質(zhì)量標準中包括對雜質(zhì)的檢測，或作為中控檢測，同時制訂一個高于原料藥中可接受限度的質(zhì)量標準，采用適當?shù)姆治龇椒?，配合?jīng)過證明雜質(zhì)致命知識，雜質(zhì)在后續(xù)工藝中被清除的知識，并對后續(xù)工藝進行控制，保證原料藥中的該雜質(zhì)殘留水平低于可接受限度，而不需要在后續(xù)工藝中再行檢測。當實驗室級試驗（鼓勵采用加樣試驗）數(shù)據(jù)，必要時可以采用中試生產(chǎn)或商業(yè)批次數(shù)據(jù)加以支持，顯示原料藥中雜質(zhì)水平低于可接受限度的30% 時，可以采用該方法。
第四種方法
對工藝參數(shù)和殘留雜質(zhì)水平（包括致命性和清除知識）影響有了解，確信原料藥中的雜質(zhì)一定會低于可接受限度，此時，建議該雜質(zhì)不需要進行分析測試（例如，不需要將雜質(zhì)列在任何質(zhì)量標準中）。如果生產(chǎn)工藝的化學特性和工藝參數(shù)對誘變雜質(zhì)的影響水平是已知的，并且最終原料藥中雜質(zhì)殘留超出可接受限度的風險已經(jīng)評估并認為是可以忽略的，那么可以采用對工藝的控制來取代采用分析方法控制。在很多情況下，只需要根據(jù)科學原理對該控制方法進行論述就可以了?？茖W風險評估要素可以用來論證第4種方法。可以根據(jù)對雜質(zhì)去向和消除產(chǎn)生影響的理化特性和工藝因素，包括化學反應(yīng)性、溶解性、揮發(fā)性、離解性和所有用于去除雜質(zhì)的物理處理步驟進行風險評估。該風險評估的結(jié)果可以用來作為雜質(zhì)被工藝所清除的預估因子。第4種方法特別適用于那些本質(zhì)上來說就不穩(wěn)定的雜質(zhì)（例如亞硫酰氯與水迅速完全反應(yīng)），以及那些在合成路線早期引入，但已被有效清除的雜質(zhì)。有些情況下，如果已經(jīng)知道雜質(zhì)是在合成后期引入或形成的，則也可以采用第4種方法，但這時，需要提交與工藝相關(guān)的數(shù)據(jù)來論述該方法的合理性。
在ICH M7中，除了給出這四種參考控制方法，還對具體用哪種方法，對哪些因素進行考慮，以及上市申報CTD需要提供哪些依據(jù)文件等，給出了一些具體說明，在此處不再累述。
基因毒性雜質(zhì)檢測決策樹
3如何檢測基因毒性雜質(zhì)
如前章所述，針對雜質(zhì)的不同毒性、服藥期長短等，設(shè)置不同的閾值，則需要相應(yīng)不同檢測手段，即開發(fā)擁有不同的檢測限的分析方法。
下面就分別介紹這幾種檢測手段的特點：
相同的化合物，使用UPLC代替HPLC，不僅檢測速度增加，靈敏度也會提升好幾倍，所以使用UPLC/UV對常規(guī)限度較高的基因毒性雜質(zhì)都會有較好的效果。
如使用UPLC/UV 方法檢測苯磺酸氨氯地平樣品中的苯磺酸甲酯（MBS）和苯磺酸乙酯（EBS），在苯磺酸氨氯地平樣品中加標15 ppm MBS和EBS六次進樣的疊加譜圖。
可看出，對這一特定樣品，UPLC/UV檢測即可達到FDA和EMEA對MBS和EBS 的檢測水平要求。
當然，與UPLC相連的檢測器也不局限于UV，根據(jù)化合物特性，如待檢測雜質(zhì)有熒光發(fā)色基團，則可使用熒光檢測器與超高效液相連接，得到較好的靈敏度。
由HPLC轉(zhuǎn)化成UPLC方法，檢測速度和靈敏度都會大幅提升
加標15 ppm苯磺酸甲酯和苯磺酸乙酯的苯磺酸氨氯地平樣品的UV分析
2D UPLC系統(tǒng)由兩個溶劑管理器、一個樣品管理器、一個色譜柱管理器和檢測器共同組成。它的應(yīng)用廣泛，在藥物領(lǐng)域中，最常用到的即為進一步增加分離度、增加靈敏度的功能。
使用UPLC二維技術(shù)，可以通過增大進樣量的方式來提高靈敏度。使檢測限在UPLC/UV的基礎(chǔ)上進一步提升。
在一維體系中，大體積進樣，并將目標雜質(zhì)和API有最基本的分離，然后將目標雜質(zhì)（下圖中綠色部分）切入二維進一步分離，得到無干擾的目標雜質(zhì)峰，進行定量更準確。從下圖的定量檢測結(jié)果可看出，即使在5 ppm的較低含量下，也有較好的回收率。
大體積進樣提高靈敏度，將第一維中綠色部分切入到二維體系中
在二維中進一步分離并定量
二維中雜質(zhì)定量結(jié)果
使用UPLC/UV檢測器檢測基因毒性雜質(zhì)，雖然對目標雜質(zhì)會有較好的響應(yīng)，但因其中API的濃度很高，且API中包含的其他雜質(zhì)很可能會對目標的基因毒性雜質(zhì)產(chǎn)生干擾，即有些雜質(zhì)與目標基因毒性雜質(zhì)有相同或?qū)⒔谋Ａ魰r間，易出現(xiàn)假陽性或回收率不好的現(xiàn)象。所以說UPLC/UV的方法抗干擾能力及假陽性率會比較高。
而使用超高效液相與質(zhì)譜檢測器連接，就可以很好的解決此問題。使用質(zhì)譜檢測器不但能得到更好的靈敏度而且抗干擾能力更強。
Waters研發(fā)的新型質(zhì)譜檢測器QDa，單四極桿、擁有一般質(zhì)譜的功能，可用于定性和定量；其體積小巧，與UV檢測器大小相同；一鍵式開關(guān)，即開即用型，開機后儀器自動校準，一刻鐘真空即可抽好；軟件參數(shù)設(shè)置簡單；成本低且維護成本也低；利于研發(fā)與QC間方法轉(zhuǎn)移。
使用UPLC/UV檢測苯磺酸氨氯地平樣品中加標15ppm MBS和EBS六次進樣的疊加譜圖。使用單四極質(zhì)譜檢測器檢測結(jié)果見下圖，其抗干擾能力大大增加。
加標15 ppm苯磺酸甲酯和苯磺酸乙酯的苯磺酸氨氯地平的MS分析
當追求更低的檢出限時，具體更高靈敏度的三重四極桿，常常是用戶的最佳選擇。Waters有多種型號的三重四極桿可供用戶選擇，強大穩(wěn)定且久經(jīng)驗證的Xevo TQD、有進一步提高靈敏度和耐用性的Xevo TQ-S micro、還有邁向極致靈敏度的Xevo TQ-S。一般情況下，使用Xevo TQD三重四極桿就可以完全滿足基因毒性雜質(zhì)的檢測限要求。采用Xevo TQD質(zhì)譜儀檢測甲磺酸，可輕松測定至0.1 ng/mL的濃度。
三重四極桿可通過多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）模式借助MS/MS功能來實現(xiàn)極致的定量，如達到ppb級別，甚至是ppt級別。并且軟件有自動開發(fā)功能，自動查找最佳的MS/MS離子對和碰撞電壓。通過軟件的定量工作流程使整個分析從頭到為都是最簡化最快速。
同時可使用“RADAR”功能，查看基質(zhì)對雜質(zhì)檢測的干擾情況，使用戶能夠全面了解情況，進而更快速更有信心的開發(fā)方法。
借助子離子確認掃描（PICs）這一功能，用戶在做定量檢測的同時，可通過PICs 自動觸發(fā)子離子掃描，得到其二級碎片譜圖，用于對目標化合物的進一步確證。
使用UPLC/Xevo TQD 檢測0.1 ng/mL 的甲磺酸
隨著對雜質(zhì)定性方面的要求更多，越來越多的用戶也會考慮使用飛行時間質(zhì)譜對基因毒性雜質(zhì)進行檢測。
來源：Internet
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