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嘉峪檢測網(wǎng) 2020-06-30 11:43
前言
對于藥學(xué)領(lǐng)域的方法驗證ICH、藥典委員會、CDE等權(quán)威機(jī)構(gòu)都有相應(yīng)的指導(dǎo)原則，雖然內(nèi)容各有不同，但總的思路和原則其實(shí)是一致的。指導(dǎo)原則寫的是一些很寬泛的指南性的內(nèi)容，很少涉及具體操作以及為什么要這么做。筆者撰寫本文的目的就是根據(jù)自己的經(jīng)驗和理解，深入剖析每個驗證概念的含義，詳細(xì)說明方法驗證應(yīng)該怎么做，為什么要這么做，以此為新進(jìn)入藥學(xué)研究領(lǐng)域的同仁解決所以然的問題。目標(biāo)定這么大，而能力又實(shí)在有限，不當(dāng)之處在所難免，敬請方家指正。以下具體操作過程及相應(yīng)數(shù)值，可以作為參考，并不一定適用于所有情況。
一、專屬性
1.概念解析
專屬性系指在其他成分(如雜質(zhì)、降解產(chǎn)物、輔料等）存在下，采用的分析方法能正確測定被測物的能力。
這句話的意思是被測物在其他成分的干擾存在下，依然能得出合理的結(jié)果。除去被測物之外，所有其他成分都是干擾源，以含量測定（外標(biāo)法）為例，被測物是主成分峰，除此之外的供試品溶液中的一切其他成分都是干擾，包括稀釋劑、輔料、有關(guān)物質(zhì)、無機(jī)鹽、殘留溶劑等等。研究不可能覆蓋所有的可能性，只需要研究高風(fēng)險因素，一般來說稀釋劑、輔料和有關(guān)物質(zhì)是專屬性的高風(fēng)險因素。
2.怎么做？為什么？
1)主成分峰純度
在專屬性驗證的相關(guān)實(shí)驗中，主成分峰都應(yīng)該考察峰純度，確認(rèn)主成分峰為單一成分的峰。具體做法是用DAD檢測器進(jìn)行峰純度掃描或者用LC-MS確認(rèn)沒有其他成分。
2)稀釋劑
應(yīng)考察稀釋劑對被測物的干擾，空白稀釋劑出的峰應(yīng)不干擾被測物。具體做法是按照質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的進(jìn)樣量檢測空白稀釋劑，記錄色譜圖。
3)輔料
取質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定量的供試品中等量的空白輔料，按照規(guī)定分析處理，記錄色譜圖，空白輔料峰應(yīng)不干擾被測物。
4)有關(guān)物質(zhì)
有關(guān)物質(zhì)分為兩大塊：工藝雜質(zhì)和降解雜質(zhì)。如果在二者均可獲得的情況下，將雜質(zhì)分別定位，并配制一份混合溶液，根據(jù)檢測內(nèi)容的不同分別研究。含量測定各雜質(zhì)峰應(yīng)不干擾主成分的檢測，即各雜質(zhì)峰應(yīng)和主成分峰達(dá)成基線分離，各雜質(zhì)峰之間沒有要求，重疊也無妨，因為含量測定只需確認(rèn)主成分峰不受干擾即可。有關(guān)物質(zhì)中各雜質(zhì)峰和主成分峰之間的分離度均應(yīng)符合要求，一般不小于1.5。特殊情況可將某些雜質(zhì)合并控制，如互為對映異構(gòu)體的非對映異構(gòu)體，它們在反相色譜法中一般都是重疊的峰。
如降解雜質(zhì)不可獲得，應(yīng)進(jìn)行酸堿氧化破壞條件下考察可能的降解雜質(zhì)的干擾，該實(shí)驗一般都做，但不是必須做，如果已經(jīng)對降解雜質(zhì)有了充分的研究，就無需做破壞實(shí)驗。例如已經(jīng)有了有效期內(nèi)長期穩(wěn)定性的研究結(jié)果，確認(rèn)了穩(wěn)定性期間的實(shí)際降解雜質(zhì)。因為有些情況下，破壞實(shí)驗的結(jié)果不是真實(shí)可能的降解雜質(zhì)，這種情況以雙氧水進(jìn)行氧化破壞最為常見，破壞產(chǎn)物雜亂無章，甚至有可能因為該實(shí)驗推翻分析方法。降解實(shí)驗室一個很大的內(nèi)容，所以在下個章節(jié)詳細(xì)論述，需要注意降解實(shí)驗應(yīng)歸屬在專屬性驗證項下。
二、降解實(shí)驗
降解實(shí)驗的做法各相關(guān)指導(dǎo)原則都沒有提出具體的措施，所以各個實(shí)驗室做法各有不同，本文闡述的是個人看法，并力圖證明其合理性。
為盡量避免降解實(shí)驗產(chǎn)物與實(shí)際可能產(chǎn)生的降解雜質(zhì)的不一致的可能，降解實(shí)驗應(yīng)為長時間弱條件下進(jìn)行。本人不建議用強(qiáng)條件如高濃度酸堿和雙氧水并輔助加熱等做法，因為強(qiáng)條件下可能會形成二次降解產(chǎn)物，并出現(xiàn)許多降解產(chǎn)物峰，增加方法驗證的難度，而實(shí)際穩(wěn)定性期間出現(xiàn)的降解雜質(zhì)可能就一兩個甚至沒有。
降解實(shí)驗的目的為了預(yù)測穩(wěn)定性期間的降解雜質(zhì)，不是為了破壞而破壞。比如有說法應(yīng)將主成分破壞5%-20%之間，但是一般條件破壞不了，就加強(qiáng)條件，必須在這范圍內(nèi)。而這是沒有必要的，也是不合理的。以下內(nèi)容詳細(xì)論述我的降解實(shí)驗的一般做法，個人見解，僅供參考。
1.破壞條件與操作
配制一份5/10倍濃度的供試品儲備液，分別取5ml置25/50ml量瓶中，分別加入0.1mol/l鹽酸溶液、0.1mol/l氫氧化鈉溶液、0.1%雙氧水溶液(如氧化破壞雜質(zhì)多而亂，可考慮更弱的條件，如溶液中充氧氣飽和)5ml，室溫放置1天，酸、堿分別加等量堿、酸中和，再分別加稀釋劑稀釋至刻度。
另分別取0.1mol/l鹽酸溶液、0.1mol/l氫氧化鈉溶液、0.1%雙氧水溶液5ml置量瓶中，同法操作，作為各破壞條件下的空白。如為制劑，應(yīng)同法做空白輔料的破壞實(shí)驗。
取上述5/10倍濃度的供試品儲備液5ml置25/50ml量瓶中，加稀釋劑至刻度，作為供試品溶液。
分別取上述溶液，按照質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定進(jìn)行分析，記錄色譜圖。
注意：酸、堿和雙氧水溶液濃度和放置時間均可以根據(jù)破壞情況進(jìn)行調(diào)整，如某個條件有降解傾向，應(yīng)調(diào)節(jié)條件使破壞至5%-20%之間。如三者均未發(fā)現(xiàn)降解傾向，再放置一段時間如10天，依然如此，既可說明本化合物非常穩(wěn)定，穩(wěn)定性期間應(yīng)不會產(chǎn)生降解雜質(zhì)。本人有一個項目按此條件做破壞，均未產(chǎn)生破壞產(chǎn)物，長期穩(wěn)定性試驗2年，有關(guān)物質(zhì)檢測結(jié)果和0天分毫不差。
2.數(shù)據(jù)報告
1)峰純度
各條件下的峰純度應(yīng)符合要求。
2)分離度
含量測定方法各破壞產(chǎn)物應(yīng)與主成分達(dá)成基線分離，有關(guān)物質(zhì)方法各破壞產(chǎn)物與主成分、現(xiàn)有雜質(zhì)之間的分離度均應(yīng)不小于1.5。
3)質(zhì)量守恒
有關(guān)物質(zhì)檢測方法需要做質(zhì)量守恒的驗算，應(yīng)評估主成分減少的量與雜質(zhì)增加的量的一致性。理論上如主成分減少10%，雜質(zhì)應(yīng)增加10%，才能說明有關(guān)物質(zhì)方法能準(zhǔn)確檢出所有的降解雜質(zhì)。如二者不一致，則證明方法有缺陷，或為降解雜質(zhì)未檢出，或為降解雜質(zhì)研究不充分，因為沒有獲得主要降解雜質(zhì)的對照品，不清楚主要降解雜質(zhì)的校正因子。
4)質(zhì)量守恒驗算方法
如主成分峰在線性范圍內(nèi)，可將供試品溶液的主峰峰面積和校正后的總雜質(zhì)峰面積之和A供除以與破壞后的溶液主峰峰面積和校正后的總雜質(zhì)峰面積之和A破，其限度應(yīng)在98%-102%之間。即A供/A破的值應(yīng)在98%-102%之間。制定此限度的依據(jù)是藥典液相系統(tǒng)適用性實(shí)驗連續(xù)進(jìn)樣5針，允許RSD不大于2%，也即數(shù)據(jù)2%以內(nèi)的誤差可以歸屬為儀器引入。
如主成分不在線性范圍內(nèi)，則可測定供試品溶液和破壞后的溶液的主成分含量和有關(guān)物質(zhì)，含量減少值除以有關(guān)物質(zhì)增加值，限度應(yīng)在90%-110%之間。制定這個依據(jù)源自校正因子0.9-1.1之間都可不加校正因子計算有關(guān)物質(zhì)，表明雜質(zhì)結(jié)果允許10%的誤差。
以上兩個限度非官方規(guī)定，為合理限度，僅供參考，實(shí)際工作中可根據(jù)情況進(jìn)行調(diào)整，本文中涉及的大部分?jǐn)?shù)字都是如此。
3.補(bǔ)充說明
降解實(shí)驗可以有關(guān)物質(zhì)和含量測定同時做，二者可以共用同一份破壞樣品，減少工作量，一般來說有關(guān)物質(zhì)的供試品濃度大于含量測定，可以將有關(guān)物質(zhì)破壞后的溶液稀釋至含量測定規(guī)定濃度。具體如何操作請讀者諸君自己設(shè)計。
三、準(zhǔn)確度
1.概念解析
準(zhǔn)確度系指采用該方法測定的結(jié)果與真實(shí)值或參考值接近的程度，一般用回收率（％ )表示?；厥章蕦?shí)驗一般在有關(guān)物質(zhì)、殘留溶劑、制劑含量測定中較為常見，因為需要考察被測物在有其他成分的干擾情況下準(zhǔn)確檢測的能力，如有關(guān)物質(zhì)會收到主成分的干擾，制劑含量測定受到輔料干擾等?；厥章蕦?shí)驗在原料藥含量測定卻是一種無法操作的尷尬處境。用原料藥對照品標(biāo)定沒有任何干擾的原料藥對照品自己？下文將闡述準(zhǔn)確度驗證的操作方法。
2.含量測定準(zhǔn)確度
1)制劑含量測定
一般平行配置三份10倍濃度對照品儲備液，分別取8、10、12ml置于預(yù)先加入相應(yīng)量的空白輔料的100ml量瓶中，稀釋制成80%、100%、120%的供試品濃度的9份溶液，取其中兩份10倍濃度對照品儲備液制成對照品溶液，分別取上述溶液按質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分析處理，按外標(biāo)法計算得出上述9份溶液的含量，再除以對照品實(shí)際加入量，得出回收率數(shù)據(jù)，回收率應(yīng)符合規(guī)定。
為什么是驗證80%、100%、120%的供試品濃度溶液，而不是其他？這是因為質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定的是“取相當(dāng)……約…….mg”,也就意味著供試品濃度一般在100%±10%范圍內(nèi)，即使考慮儀器和操作誤差，那么80%-120%的區(qū)間一定包括了實(shí)際檢測過程中供試品濃度所在的區(qū)間，再大的區(qū)間沒有必要。含量測定的線性范圍原因同樣如此，溶出度線性范圍和準(zhǔn)確度范圍與此不同。
2)原料藥含量測定
一般來說，不具有可操作性，所以我在實(shí)際工作中不進(jìn)行相關(guān)驗證。因為指導(dǎo)原則有原文指出“準(zhǔn)確度也可由所測定的精密度、線性和專屬性推算出來”，也就是說如果精密度、線性和專屬性驗證均符合要求，則準(zhǔn)確度必定符合要求，無需驗證。但總有人擔(dān)心審評老師找麻煩，硬是要做這個，就推薦兩個我所知的同仁的做法供大家參考。
一是9份準(zhǔn)確度溶液中原料藥和原料藥對照品各一半，另外一種做法是用原料藥對照品按外標(biāo)法計算原料藥對照品的含量，其結(jié)果和對照品的標(biāo)定值做對比。
3.殘留溶劑準(zhǔn)確度
以最常用的頂空進(jìn)樣法為例，配制一份2倍濃度供試品儲備液，取質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中1/2體積的儲備液分別置10個頂空瓶中。其中一份加入1/2體積的稀釋劑，作為供試品溶液。配制一份10倍濃度對照品溶液，稀釋制成50%、80%、100%規(guī)定濃度的2倍儲備液（該項可以商酌，個人認(rèn)為溶劑殘留超標(biāo)即不合格，超過100%準(zhǔn)確度可不驗證）1/2體積，分別加入上述剩余9個頂空瓶中，作為準(zhǔn)確度檢測溶液。另取10倍濃度對照品溶液，稀釋制成100%規(guī)定濃度溶液，作為對照品溶液。依法測定，計算供試品與準(zhǔn)確度檢測溶液溶劑殘留值，二者之差除以對照品實(shí)際加入值，回收率應(yīng)符合規(guī)定。
4.有關(guān)物質(zhì)準(zhǔn)確度
分別配制一份10倍濃度供試品溶液與規(guī)定限度雜質(zhì)對照品混合儲備液，取5ml供試品儲備液置50ml量瓶中，加稀釋劑稀釋至刻度，作為供試品溶液。如為自身對照法，依法配制對照液。取供試品儲備液5ml，分別置9個容量瓶中，分別加入適量雜質(zhì)對照品混合儲備液制成50%、100%、150%限度各三份的準(zhǔn)確度溶液。取上述溶液，依法測定，計算供試品已有雜質(zhì)含量、加雜準(zhǔn)確度溶液雜質(zhì)含量，二者之差除以雜質(zhì)對照品實(shí)際加入量，即為回收率，應(yīng)符合規(guī)定。
需要注意的是，有關(guān)物質(zhì)準(zhǔn)確度的數(shù)據(jù)應(yīng)該按照質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定處理，例如質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定為加校正因子的自身對照法，則應(yīng)該按照質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的規(guī)定計算各樣品溶液的雜質(zhì)含量，并計算回收率。舉例如下：在5mg的供試品溶液中加入了5μg的雜質(zhì)，實(shí)際加入量為0.10%，供試品該雜質(zhì)的本底量為0.01%，加雜后根據(jù)加校正因子的自身對照法計算實(shí)測值為0.105%，則回收率=（0.105-0.01）/0.10=95%。偶見用外標(biāo)法計算有關(guān)物質(zhì)的回收率，而質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的是自身對照法。這背離了方法驗證的本意，方法驗證應(yīng)該驗證方法自身的準(zhǔn)確度。如果用外標(biāo)法回收率合格，但線性驗證出現(xiàn)問題，校正因子計算不準(zhǔn)確，導(dǎo)致實(shí)際工作中檢測結(jié)果偏離真實(shí)值，而方法驗證卻判斷符合要求，這明顯是不合理的。
5.其他
如溶出度、異構(gòu)體、某些基因毒性雜質(zhì)等檢測方法的準(zhǔn)確度驗證，限于篇幅所限，不再一一列舉，但都可以參照以上做法的思路設(shè)計實(shí)驗方案。
四、定量限與檢測限
1.定量限
定量限系指試樣中的被分析物能夠被定量測定的最低量，其測定結(jié)果應(yīng)具有一定的準(zhǔn)確度和精密度。從這一概念出發(fā)，應(yīng)確定信噪比為10的供試品的濃度是理所當(dāng)然的。然而響應(yīng)情況隨著儀器與流動相的不同而不同，在方法驗證時所選儀器與流動相得出的信噪比為10的供試品的濃度不具有普遍意義上的代表性，這只是一個偶然值。我們在實(shí)際工作中其實(shí)無需確定信噪比為10的供試品的濃度，只需證明方法需定量的限度的合理性。以下舉例說明：若方法報告限規(guī)定為0.05%，那么肯定需要證明此限度能準(zhǔn)確定量，如不能準(zhǔn)確定量，則此項規(guī)定不合理。我們可以稀釋制成0.01%的相應(yīng)溶液，注入儀器檢測，其信噪比如大于10，則證明方法有合理的定量限。無需費(fèi)時費(fèi)力找出每個雜質(zhì)的信噪比10的濃度，特別是已知雜質(zhì)數(shù)量較多的情況下，工作量將極為巨大。直接稀釋至特定濃度考察信噪比，則非常簡單，只需將線性驗證項下的混合雜質(zhì)溶液稀釋至目標(biāo)濃度即可。
還有一種簡單的計算LOQ的方法就是根據(jù)線性驗證的結(jié)果計算，公式為LOQ=10×STEYX/斜率，STEYX為線性數(shù)據(jù)的剩余標(biāo)準(zhǔn)偏差，可以用EXCEL直接算出這個值。
LOQ濃度樣品應(yīng)連續(xù)進(jìn)樣6次，考察響應(yīng)的精密度。
2.檢測限
可將上文舉例的0.01%溶液稀釋2-5倍直接考察信噪比，大于3即可。也可由公式LOD=3.3×STEYX/斜率計算得出檢測項濃度。
五、線性與范圍
該項驗證各指導(dǎo)原則已經(jīng)有較為詳細(xì)的說明，故沒有太多論述的必要。我在此僅說明一下進(jìn)行此項需要注意的地方。在有關(guān)物質(zhì)線性驗證中，除面積歸一法之外，范圍不宜太寬，否則相關(guān)系數(shù)較差，截距較大。如果波長較小，接近流動相截止波長，則流動相本底吸收較大，則更要縮小線性驗證的范圍。每個點(diǎn)峰面積為供試品實(shí)際響應(yīng)值減去流動相本底值。日常工作中細(xì)心的同志應(yīng)該能發(fā)現(xiàn)在高流動相本底吸收的低濃度下響應(yīng)遠(yuǎn)小于高濃度響應(yīng)除以相應(yīng)稀釋倍數(shù)的值，就是由于流動相本底的影響。一般有關(guān)物質(zhì)線性范圍可以是限度的20%、50%、80%、100%、120%、150%。還需注意的是線性范圍應(yīng)包括準(zhǔn)確度的三個值。
六、耐用性
耐用性系指測定條件發(fā)生小的變動時，測定結(jié)果不受影響的承受程度。此概念看定義就能清楚理解，沒有敘述的必要。故只提供一下本人在實(shí)際工作中的做法。一般來說耐用性每種條件變動，都應(yīng)該考察系統(tǒng)適用性，證明系統(tǒng)適用性不受影響，如有關(guān)物質(zhì)考察是否符合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的分離度要求，含量測定考察進(jìn)樣精密度、拖尾因子等。我們可以與精密度驗證同時進(jìn)行，取精密度驗證中其中一個樣品為預(yù)定色譜條件，其他變動條件下測定該樣品的結(jié)果與該樣品在精密度項下的結(jié)果匯總統(tǒng)計分析。以含量測定為例，舉例如下：
如某個條件變化系統(tǒng)適用性或檢測結(jié)果不符合要求，則應(yīng)研究更小的變化區(qū)間以使相關(guān)驗證符合要求。如變化區(qū)間過小，則方法耐用性不佳，以后方法在不同實(shí)驗室轉(zhuǎn)移或者不同人員操作結(jié)果的重現(xiàn)性將存在巨大風(fēng)險。
另外需要說明的是溶液穩(wěn)定性也歸屬于耐用性驗證項下，并非獨(dú)立的驗證項。時間的變化也屬于條件的微小變化之一。一般取樣時間點(diǎn)為2、4、8、12、16、24、36、48h，如果4小時后即不穩(wěn)定，應(yīng)在質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定臨用新配。
耐用性為分析方法的挑戰(zhàn)性驗證，一個好的方法應(yīng)能在合理的盡可能大的區(qū)間內(nèi)符合驗證要求，以便于今后工作的開展。如溶液有良好的穩(wěn)定性，供試品溶液放置數(shù)天后仍然可以用來檢測；柱溫的要求很隨意，即使柱溫箱損壞也不影響檢測的進(jìn)行等等。
七、精密度
該項驗證沒有歧義較為簡單，我也僅提出一些本人的看法。值得一提與討論的是有關(guān)物質(zhì)的精密度驗證。如采用中試樣品做重復(fù)性驗證，測出某個雜質(zhì)的6個值分別為：0.01%、0.01%、0.01%、0.01%、0.01%、0.02%，該方法的重復(fù)性好不好？在實(shí)際工作中這樣的數(shù)據(jù)其實(shí)沒有任何問題，并不影響對結(jié)果的判斷，因為這可能只是0.014%和0.015%的差別，但由于2015年版中國藥典四部在其指導(dǎo)原則中對有關(guān)物質(zhì)精密度驗證的RSD提出了近乎天方夜譚的要求，它要求必須計算RSD還必須滿足它的要求。那么上述數(shù)據(jù)就完全不可能滿足相應(yīng)的限度要求。對于這種用強(qiáng)權(quán)強(qiáng)奸真理不顧客觀事實(shí)一刀切的做法，我也只能無視了。RSD考察有關(guān)物質(zhì)的精密度在上述數(shù)據(jù)中會顯出一個非常高的數(shù)據(jù)，但是這其實(shí)并沒有什么意義。有關(guān)物質(zhì)檢測結(jié)果的統(tǒng)計分析還可以用極差的方式，如認(rèn)為實(shí)際工作中報告的結(jié)果±0.01%都可以接受，那么單雜的極差不大于0.02%，即可說明方法具有良好的精密度。
可能有些同仁還是不放心，因為審評老師可能不會那么講道理，那我就推薦一種做法，即在供試品中加入限度規(guī)定量的雜質(zhì)對照品，這樣的話RSD將小很多。具體做法如下：分別配制一份10倍濃度供試品儲備液與10倍濃度雜質(zhì)儲備液，各取2ml置同一20ml量瓶中，平行配制6份，以此作為精密度驗證用樣品。
八、后述
方法驗證的題目取的有點(diǎn)大，寫了很多，但發(fā)現(xiàn)還是有很多問題淺嘗即止，未能深入闡述。再次重申，以上所有具體操作與限度值未必適用于所有情況，可以作為進(jìn)行調(diào)整的參考，且為個人看法，非客觀真理，能力所限，錯誤之處在所難免，歡迎撰文駁斥。
來源：占小兵/藥事縱橫
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