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1.HPLC色譜分離模式的選擇

在建立化合物的HPLC方法時(shí)，可以首先根據(jù)化合物的分子量大小，極性大小及PKa，選擇合適的分離模式，在適當(dāng)?shù)姆蛛x模式下去再去優(yōu)化同類的色譜柱及流動(dòng)相?；衔锓肿恿?lt;2000Da時(shí)，可根據(jù)圖1來選擇：

圖1 分子量<2000Da的分離模式

化合物分子量>2000Da時(shí)，可按圖2來選擇

圖2分子量>2000Da的分離模式

2.反相鍵合相色譜柱性能影響因素

對于大部分小分子化合物來說都可以選擇鍵合相的反相色譜，下面先分析反相鍵合相色譜柱性能的影響因素，只有了解影響色譜柱性能的因素，才能結(jié)合目標(biāo)分析物的性質(zhì)、需要達(dá)到的分析效果及實(shí)驗(yàn)室條件來選擇適合的色譜柱。

2.1 影響色譜柱性能的物理參數(shù)：

⑴硅膠純度

硅膠純度和殘留金屬離子濃度，硅膠的雜質(zhì)會(huì)影響化合物的峰形，硅膠表面的金屬含量高會(huì)影響堿性化合物的峰形，發(fā)生拖尾。

⑵色譜柱尺寸

填料床的長度和內(nèi)徑，增加色譜柱長度，可以提高分辨率；寬柱徑，提高載樣量。

⑶顆粒形狀及粒徑

球型或不規(guī)則形，球形顆粒柱效高、重現(xiàn)性好、柱床結(jié)構(gòu)均勻，不規(guī)則形柱床結(jié)構(gòu)不均勻、流動(dòng)相線速度不均勻，容易譜帶展寬；平均顆粒直徑，粒徑越小，柱效越高，柱壓也越高。粒徑分布越廣則柱效越低。

⑷顆粒表面積

顆粒外表面和內(nèi)部孔表面的總和，以m2/g表示，相對而言高表面積對樣品具有較強(qiáng)的保留能力，更大的柱容量和分離度。而低表面積能更快達(dá)到平衡狀態(tài)，更適合梯度洗脫程序。

⑸孔徑

顆粒的孔或腔的平均尺寸，范圍是80~300Å，大孔徑的填料顆?？梢匝娱L大分子溶質(zhì)在填料表面的滯留時(shí)間，改善分離，所以大孔徑填料適合分離大分子化合物或者水動(dòng)力體積較大的分子。

2.2 影響色譜柱性能的化學(xué)因素

⑴鍵合類型及鍵合相

鍵合相分子與基體單點(diǎn)相連為單體鍵合，這種鍵合方式可以提高傳質(zhì)速率，縮短柱平衡時(shí)間，聚合體鍵合為鍵合相分子與基體多點(diǎn)相連，這種建和方式可以增加色譜柱穩(wěn)定性，增加載樣量；鍵合相不同會(huì)直接影響化合物的保留行為。

⑵碳覆蓋率

高碳覆蓋率可以提高分辨率和重現(xiàn)性，但分析時(shí)間長。

圖 3高低碳覆蓋率

⑶封端

硅膠鍵合相填料中有部分未封端的殘留硅羥基，如圖封端可以減輕待測組分與硅膠表面殘留的酸性硅羥基反應(yīng)，改善保留和峰形，這對于堿性化合物尤其重要。

圖4 硅膠鍵合相填料

3.反相鍵合相色譜柱的選擇

3.1 重現(xiàn)國標(biāo)文獻(xiàn)中方法

選擇色譜柱粒徑、比表面積、基質(zhì)表面特性、鍵合類型等相似的色譜柱，或者利用USP網(wǎng)站及一些色譜柱選擇軟件，如“column selector for acd/chemsketch”來查詢相似系數(shù)。選擇相似系數(shù)高的色譜柱。 

3.2 建立新化合物分離分析方法的色譜柱選擇

根據(jù)目標(biāo)分析物的分子量大小、溶解性、Pka值，以及分離要求、儀器、成本等各方面來選擇色譜柱。

⑴粒徑（1.7μm、3μm、5μm等），根據(jù)分析時(shí)間要求（粒徑小，分析速度快）、靈敏度、儀器（粒徑越小，壓力越高）、價(jià)格等來選擇

⑵比表面積，高比表面積有助于分離，低比表面積更適合梯度洗脫程序

⑶孔徑，大分子化合物適合大孔徑，在保證比表面積的前提下，選擇孔徑大的。

⑷鍵合相的選擇

下圖是常見的化學(xué)鍵合相及其運(yùn)用范圍。

圖5 化學(xué)鍵合相的類型及其應(yīng)用范圍