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摘要

 

分析方法專屬性的驗證中，有信號響應(yīng)的組分，可以以分離度來評估干擾，那么無信號響應(yīng)的組分如輔料、緩沖鹽等該如何評估其對測定結(jié)果的干擾，本文結(jié)合USP1200相關(guān)理念，將無信號響應(yīng)組分與測定結(jié)果的影響關(guān)聯(lián)起來，目的是提醒分析同行在進行分析方法開發(fā)初期就應(yīng)該關(guān)注該問題，不足和缺陷之處望同行批評指正。

 

一、名詞解釋

專屬性：系指在其他成分（如雜質(zhì)、降解產(chǎn)物、輔料等）存在下，采用的分析方法能正確測定被測物的能力（屬于準確度的一個組成部分）。

基質(zhì)效應(yīng)：指的是樣品中除分析物以外的組分對測定結(jié)果的影響，包括有信號響應(yīng)組分和無信號響應(yīng)組分。

 

二、基質(zhì)效應(yīng)的類別

2.1有信號響應(yīng)的組分：

對于有信號響應(yīng)的組分，其誤差量可以通過精度誤差與分辨率之間的非線性對應(yīng)關(guān)系來控制。當峰之間的分離度為NLT1.5時，對于大多數(shù)的情況，誤差將被控制在可接受的水平。

根據(jù)2020版《中國藥典》9101項下相關(guān)規(guī)定，在雜質(zhì)對照品可獲得的情況下，對于含量測定，試樣中可加入雜質(zhì)或輔料，考察測定結(jié)果是否受干擾，并可與未加雜質(zhì)或輔料的試樣比較測定結(jié)果。對于雜質(zhì)檢查，也可向試樣中加入一定量的雜質(zhì)，考察各成分包括雜質(zhì)之間能否得到分離。在雜質(zhì)或降解產(chǎn)物不能獲得的情況下，可將含有雜質(zhì)或降解產(chǎn)物的試樣進行測定，與另一個經(jīng)驗證了的方法或藥典方法比較結(jié)果。也可用強光照射、高溫、高濕、酸（堿）水解或氧化的方法進行加速破壞，以研究可能存在的降解產(chǎn)物和降解途徑對含量測定和雜質(zhì)測定的影響。含量測定方法應(yīng)比對兩種方法的結(jié)果， 雜質(zhì)檢査應(yīng)比對檢出的雜質(zhì)個數(shù)，必要時可采用光二極管陣列檢測和質(zhì)譜檢測，進行峰純度檢查。

 

2.2、無信號響應(yīng)的組分：

 

對于如何評估無信號響應(yīng)組分對測定結(jié)果的影響，通常有以下兩種方式

 

1）標準曲線法（USP1200）

 

When applied to an Assay procedure, the bias caused by nonspecific detection of components is NMT one-third the bias allowed in the Precision–Accuracy study. The spiked solution is prepared with interference levels that are higher than expected in order to exaggerate the response. An example for a drug substance follows

 

當應(yīng)用于分析程序時，由非特異性檢測組分引起的偏差為NMT，即“精密度—準確度”研究允許的偏差的三分之一，加標溶液的干擾水平要高于預(yù)期水平，以夸大響應(yīng)。原料藥示例如下：

 

Spiked standard solution(s): Contains the drug substance at the same concentration as the Standard solution and each specified impurity at 10 times the specified value and unspecified impurities at 1.0%

 

加標標準溶液：包含與標準溶液濃度相同的原料藥，每種規(guī)定的雜質(zhì)含量為規(guī)定值的10倍，未規(guī)定的雜質(zhì)含量為1.0％

 

Samples: Standard solution and Spiked standard solution(s) Analysis: Analyze the results, and determine the difference between the drug substance response from the Standard solution and Spiked standard solution. Using the calibration curve, calculate the percentage difference in the Assay concentration so obtained

 

樣品：標準溶液和加標溶液分析：分析結(jié)果，并確定標準溶液和尖峰標準溶液對藥物的反應(yīng)之間的差異。使用校準曲線，計算得出的測定濃度的百分比差異

 

Acceptance criteria: NMT 1%

 

可接受標準：不得超過1%

 

When applied to an impurity procedure, the level of bias is NMT one-third the precision value determined in the Precision study.

 

當應(yīng)用于雜質(zhì)檢測，偏差不得超過精密度要求的1/3。

 

Spiked standard solution(s): Contains each specified impurity at 10 times the specified value and unspecified impurities at 1.0%

 

加標標準溶液：每種規(guī)定的雜質(zhì)含量為規(guī)定值的10倍，未規(guī)定的雜質(zhì)含量為1.0％

 

Samples: Standard solution and Spiked standard solution(s)

 

樣品：標準溶液和加標標準溶液

 

Analysis: Analyze the results, and determine the difference between the impurity concentration from the Standardsolution and Spiked standard solution using the calibration curve.

 

分析：評估采用兩種不同的校正曲線測定結(jié)果的差異

 

Acceptance criteria: NMT 1% (assuming a 0.1% impurity limit)

 

可接受標準：不得過1%（如果是0.1%的雜質(zhì)限度）

 

2）響應(yīng)值法：在溶劑中目標分析物響應(yīng)值計作B，樣品基質(zhì)中添加相同含量目標分析物的響應(yīng)值計作A。基質(zhì)效應(yīng)（%）=B/A*100%，可接受標準可參照標準曲線法.

 

三、基質(zhì)效應(yīng)產(chǎn)生的途徑及原因

 

1）被分析物引入：以生物樣本為例，內(nèi)源性組分，經(jīng)前處理后仍存在于提取液中。包括離子顆粒物成分(電解質(zhì)、鹽類)、 強極性化合物(酚類、色素)和各種有機化合物(糖類、胺類、尿素、脂類、肽類及其分析目標物的同類物及其代謝物)。

 

2）由樣品處理過程引入：流動相、稀釋劑及過濾設(shè)備等引入的無機離子、緩沖溶液、有機酸、離子對試劑、增塑劑、表面活性劑等。

 

3）檢測設(shè)備：質(zhì)譜設(shè)備（ESI、APCI、EI等）由于非目標分析物與目標物共同流出噴霧針，對電荷產(chǎn)生競爭，它們將產(chǎn)生的霧滴牢牢吸在一起，阻止其分裂成更小的微滴，改變了帶電霧滴的表面張力，從而導(dǎo)致目標物的離子化效率降低或增強，引起響應(yīng)降低或增高，便產(chǎn)生了基質(zhì)抑制效應(yīng)或基質(zhì)增強效應(yīng)（如基質(zhì)中含有P=O、-O-CO-NH-、OH、R-NH-、-N=、-NH-CO-NH- 等基團）。氣相設(shè)備如進樣口、色譜柱等，基質(zhì)成分與目標分析物分子競爭進樣口或柱頭的金屬離子、硅烷基及其他活性位點，從而掩蔽了這些活性位點，使得目標分析物與活性位點接觸誘導(dǎo)的吸附。液相設(shè)備通常不會引入基質(zhì)效應(yīng)。

 

四、如何避免基質(zhì)效應(yīng)

 

1）選擇合適的樣品制備方法：合適的樣品制備方法就是凈化待測組分，去除產(chǎn)生干擾的基質(zhì)，常用的樣品處理方法包括蛋白沉淀、液液萃取和固體萃取等，但在處理過程中應(yīng)注意凈化過程對待測組分帶來的損失，兼顧基質(zhì)效應(yīng)及提取回收率。

 

2）選擇適當?shù)娜軇合♂寗﹥?yōu)先考慮流動相系統(tǒng)，如需加助溶劑，最后控制在5%以內(nèi)。對照品與供試品溶液配制方式盡量相同，如有差異應(yīng)盡量控制在2%以內(nèi)。液相色譜紫外檢測器引起基質(zhì)效應(yīng)的主要原因就是溶劑選擇不當所致。以某凍干粉為例，采用純水為稀釋劑，導(dǎo)致其中兩個主要成分出現(xiàn)裂縫現(xiàn)象，導(dǎo)致定位不準，回收率下降如圖1所示：

圖1

 

更換稀釋劑為流動相系統(tǒng)，助溶劑控制在5%以內(nèi)（因部分雜質(zhì)流動相溶解性較差），有問題的峰型明顯改善，回收率明顯提高，方法驗證順利通過。

圖2

 

3）控制供試品濃度：對于雜質(zhì)的檢測，供試品濃度應(yīng)控制在滿載不超載的水平，在確保檢測能力的前提下，減小進樣量。

 

4）凈化流動相：采用補集小柱，凈化流動相。液相色譜紫外檢測器引起基質(zhì)效應(yīng)的另一主要原因就是流動相不干凈，導(dǎo)致色譜峰峰型較差，回收率不合格，尤其是在梯度變化處更為明顯，果斷添加補集小柱。

 

5）選擇合適的檢測器：對于質(zhì)譜分析來說，消除基質(zhì)效應(yīng)還可以通過改變離子源的方式。目前用于定量的離子源主要是電噴霧離子源（ESI）和大氣壓化學離子源（APCI），通常ESI對于基質(zhì)效應(yīng)的敏感程度要高于APCI。

 

6）內(nèi)標法：在樣品中加入內(nèi)標物是藥物分析中一種有效消除基質(zhì)效應(yīng)的方法，在分析測定樣品中目標分析物時，加入一種內(nèi)標物質(zhì)消除基質(zhì)效應(yīng)對分析結(jié)果產(chǎn)生的影響，以提高分析結(jié)果的準確度。

 

7）標準加入法：標準加入法是在對照品和樣品中同時加入基質(zhì)，兩者是在同等基質(zhì)效應(yīng)影響下采集，故可以相互抵消基質(zhì)效應(yīng)的影響。該方式在殘留溶劑測定中經(jīng)常用到，2020版《中國藥典》通則0521中有這樣的描述“當采用頂空進樣時，由于供試品和對照品處于不完全相同的基質(zhì)中，故可采用標準溶液加入法，以消除基質(zhì)效應(yīng)的影響；當標準溶液加入法與其他定量方法結(jié)果不一致時，應(yīng)以標準加入法結(jié)果為準。在質(zhì)譜檢測中，該方式也常被采用，如對照品配制過程加入空白輔料等。

 

8）校正因子法：校正因子校準法消除基質(zhì)效應(yīng)實際上是利用溶劑標準曲線校正基質(zhì)匹配標準曲線獲得校正因子，建立統(tǒng)計模型。如APIC清潔驗證指南（原料2014）規(guī)定在雜質(zhì)定量測試中，回收率≥ 90%時一般認為是可以接受的。在清潔驗證中，如果回收率≥90%，在M殘留量真值計算中可以不需要考慮回收率；如果回收率<90%，則需要在M計算時加以考慮（參見公式 4），如果回收率<50%，則該方法不適用。M=MRES/R，M:清潔后設(shè)備上殘留物的數(shù)據(jù)真值，MRES測得殘留量R:回收率除以100（例如，對于75%即為75/100=0.75）。

 

五、參考文獻

[1] 1200 Requirements for Compendial Validation PF Online 39(6)

[2] 藥物色譜分析中的基質(zhì)效應(yīng)理論