概述
醛類化合物（結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1）是醫(yī)藥行業(yè)中常見(jiàn)的起始原料，例如甲醛是抗菌藥鹽酸四環(huán)素、抗血小板藥氯吡格雷重要的合成原料；用于生產(chǎn)甲硝唑等藥物的中間體2-甲基咪唑用到乙醛和乙二醛作為起始原料。醛類化合物也是多種醫(yī)藥產(chǎn)品的合成中間體，如鄰硝基苯甲醛作為有機(jī)合成中間體用于制造抗心絞痛藥物硝基吡啶（心痛定）；3-噻吩甲醛是殺菌劑、雄性激素抑制劑等藥物的重要中間體；3，4-二甲氧基苯甲醛是合成抗過(guò)敏藥曲尼司特、降壓藥哌唑嗪的中間體。另外，藥包材及輔料中存在的醛類化合物也不容忽視，比如口服液體藥用聚酯瓶在生產(chǎn)過(guò)程中，可能產(chǎn)生乙醛；長(zhǎng)春西汀注射液中的輔料維生素C降解和苯甲醇氧化后會(huì)產(chǎn)生微量的苯甲醛和糠醛；常用作生物注射劑穩(wěn)定劑的聚山梨酯類輔料也可能含有不可忽視的甲醛、乙醛等。
圖1.醛類化合物結(jié)構(gòu)圖
根據(jù)國(guó)際人用藥物注冊(cè)技術(shù)要求協(xié)調(diào)會(huì)（ICH）和歐洲藥品質(zhì)量管理局（EMA）的調(diào)查研究表明，醛類化合物均被列為潛在的基因毒性雜質(zhì)，其中甲醛和乙醛已被世界衛(wèi)生組織（WHO）確定為1級(jí)致癌物質(zhì)，甲醛可引起哺乳動(dòng)物細(xì)胞核基因突變、染色體損傷、斷裂等，乙醛會(huì)直接破壞細(xì)胞DNA結(jié)構(gòu)，誘發(fā)基因突變，甚至引起嚴(yán)重的染色體重排，對(duì)造血干細(xì)胞的影響尤為顯著。醛類化合物由于其易揮發(fā)且不具有生色團(tuán)的特性，給該類化合物分析方法的開(kāi)發(fā)帶來(lái)許多的難題。因此，探索建立快速、靈敏、準(zhǔn)確、可靠的醛類化合物分析方法，從而嚴(yán)格控制藥物和醫(yī)藥中間體中醛類化合物的含量是非常必要的。
根據(jù)參考各國(guó)藥典及文獻(xiàn)，總結(jié)了部分含有醛類基因毒雜質(zhì)藥物的種類，詳見(jiàn)表1。
表1. 含有醛類基因毒雜質(zhì)藥物列表
常用的檢測(cè)方法
直接檢測(cè)法：
目前已知報(bào)道的醛類化合物的檢測(cè)方法較多，大多采用常規(guī)的檢測(cè)方法，如分光光度法、熒光光度法、高效液相色譜法（HPLC）、氣相色譜（GC）、頂空氣相色譜法（HS-GC）、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（LC-MS）等。有文獻(xiàn)報(bào)道，采用氣相色譜法配置氫火焰離子化檢測(cè)器（FID)，液體直接進(jìn)樣測(cè)定藥物中間體2-甲基咪唑中乙醛的含量；或者采用頂空氣相色譜法，外標(biāo)法頂空自動(dòng)進(jìn)樣，非極性彈性毛細(xì)管柱分離，測(cè)定注射用氨芐西林鈉舒巴坦鈉中乙醛、異丁醛的殘留；也有文獻(xiàn)顯示，建立高效液相色譜法，以0.2 mol/L 乙酸銨-乙腈為流動(dòng)相，可以實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)春西汀注射液中基因毒雜質(zhì)苯甲醛和糠醛的含量測(cè)定；除常見(jiàn)的色譜法以外，也有人開(kāi)發(fā)出毛細(xì)管電泳聯(lián)用化學(xué)發(fā)光檢測(cè)的方法，檢測(cè)中藥丹參注射劑和片劑中的3,4-二羥基苯甲醛。
衍生化法：
醛類化合物由于其易揮發(fā)且不具有生色團(tuán)的特性而帶來(lái)很多分析難題，尤其是甲醛、乙醛等小分子量化合物，極性大出峰早，在紫外檢測(cè)器沒(méi)有吸收，在火焰離子化檢測(cè)儀的檢測(cè)器中響應(yīng)也不明顯，因此衍生化方法在輔助醛類化合物的檢測(cè)和分離的應(yīng)用中較為常見(jiàn)。比如測(cè)定利尿藥氫氯噻嗪中的甲醛含量時(shí)，可以使用乙醇作為衍生試劑，將甲醛衍生為二乙氧基甲烷進(jìn)行檢測(cè)；也有多篇文獻(xiàn)報(bào)道，使用2,4-二硝基苯肼將甲醛衍生為甲醛2,4-二硝基苯腙，從而測(cè)定藥物中甲醛的含量。比如采用柱前衍生液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法測(cè)定氯吡格雷原料藥中痕量甲醛殘留，該方法經(jīng)過(guò)2,4-二硝基苯肼衍生反應(yīng)，反相色譜柱分離，質(zhì)譜檢測(cè)器檢測(cè)（ESI源，負(fù)離子模式），完成測(cè)定；藥用輔料中醛類基因毒性雜質(zhì)衍生化法檢測(cè)的應(yīng)用也很常見(jiàn)，曾有文獻(xiàn)報(bào)道過(guò)以鄰- (2,3,4,5,6 -全氟苯基)羥基氨鹽酸鹽作為衍生化試劑，采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法測(cè)定衍生產(chǎn)物從而實(shí)現(xiàn)30+種藥用輔料如羥丙甲纖維素、羥丙基纖維素中甲醛、乙醛、丙醛、苯甲醛等多種醛類化合物的定量。
案例
氯吡格雷：
氯吡格雷（Clopidogrel，化合物1，圖2），是一種ADP受體阻滯劑，可與血小板膜表面二磷酸腺苷（ADP）受體結(jié)合，使纖維蛋白原無(wú)法與糖蛋白GPⅡb/Ⅲa受體結(jié)合，從而抑制血小板相互聚集。臨床上主要用于動(dòng)脈粥樣硬化及冠狀動(dòng)脈綜合征的治療，也用于冠狀動(dòng)脈介入術(shù)治療后血栓性并發(fā)癥的預(yù)防。在氯吡格雷的合成過(guò)程中，合成中間體4步驟使用了甲醛作為反應(yīng)原料（圖2），有在成品中殘留的風(fēng)險(xiǎn)。甲醛致癌性明確，并且會(huì)對(duì)人的神經(jīng)系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)和肝臟產(chǎn)生較大毒性，應(yīng)嚴(yán)格控制其在藥物成品中的含量。
圖2. 塞來(lái)昔布的合成工藝
該分析方法采用衍生后高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法，以2,4-二硝基苯肼為衍生化試劑，在酸催化下和甲醛發(fā)生反應(yīng)生成甲醛-2,4-二硝基苯腙，質(zhì)譜使用ESI離子源，負(fù)離子模式，選擇檢測(cè)離子m/z=209.0，從而實(shí)現(xiàn)氯吡格雷中甲醛的檢測(cè)。根據(jù)ICH指南的要求，對(duì)該方法進(jìn)行了檢測(cè)限（LOD）、線性、精密度、準(zhǔn)確性等相關(guān)驗(yàn)證，甲醛在0.05 ~ 5.0 μg/mL濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)R2 = 0.9990，甲醛的LOD能夠達(dá)到1.0×10-4 ppm，回收率范圍為92.0% ~ 106.0%。本法靈敏、可靠、準(zhǔn)確度高，可用于實(shí)際生產(chǎn)中甲醛殘留的測(cè)定與質(zhì)控，具有一定的應(yīng)用價(jià)值。
氯霉素:
氯霉素（Chloramphenicol，化合物9，圖3），是一種廣譜抗生素，通過(guò)脂溶性可彌散進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)，主要作用于細(xì)菌70s核糖體的50s亞基，抑制轉(zhuǎn)肽酶，使肽鏈的增長(zhǎng)受阻，抑制了肽鏈的形成，從而阻止蛋白質(zhì)的合成。臨床用于治療由傷寒桿菌、痢疾桿菌、大腸桿菌、流感桿菌、布氏桿菌、肺炎球菌等引起的感染。氯霉素的合成方法有對(duì)硝基苯乙酮法、苯乙烯法、肉桂醇法、對(duì)硝基苯甲醛法等，其中對(duì)硝基苯甲醛法即以對(duì)硝基苯甲醛（4-NBA，化合物10，圖2）為起始原料，經(jīng)過(guò)一系列反應(yīng)后生成氯霉素，對(duì)硝基苯甲醛也是氯霉素的光降解產(chǎn)物之一。4-NBA經(jīng)Ames試驗(yàn)證實(shí)具有致突變性，會(huì)引起DNA損傷，且結(jié)構(gòu)中的芳香醛和芳香硝基也是潛在遺傳毒性的警示官能團(tuán)，因此有必要開(kāi)發(fā)靈敏而快速的方法控制氯霉素中4-NBA的殘留。根據(jù)ICH指導(dǎo)原則，結(jié)合氯霉素的服用周期，4-NBA的最大攝取量為120 μg/d，氯霉素的最大日用劑量為3 g，則對(duì)應(yīng)的基因毒性雜質(zhì)4-NBA的限度為40 ppm。
圖3. 氯霉素合成工藝
因此，采用衍生后高效液相色譜-紫外檢測(cè)方法測(cè)定氯霉素樣品中4-NBA，以3-硝基苯肼鹽酸鹽為衍生試劑，可以最大程度的減少藥物基質(zhì)和衍生試劑的干擾。本方法通過(guò)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，優(yōu)化出最佳衍生化條件，即在60℃下與500 μg/mL的3-硝基苯肼鹽酸鹽在乙腈-水（70:30，v/v）中反應(yīng)30分鐘，得到合適的衍生物，HPLC-UV法測(cè)定衍生物以實(shí)現(xiàn)4-NBA的定量。根據(jù)ICH指南的要求，對(duì)該方法進(jìn)行了檢測(cè)限（LOD）、定量限（LOQ）、線性、精密度、準(zhǔn)確性等相關(guān)驗(yàn)證，4-NBA在0.03~0.3 μg/mL濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)R2 = 0.9994，4-NBA衍生物的LOD和LOQ分別能夠達(dá)到0.009 μg/mL及0.03 μg/mL，回收率范圍為97.8% ~ 112.1%，RSD平均值為1.42 %。本法靈敏、可靠，適合在痕量水平下對(duì)氯霉素中4-NBA進(jìn)行控制，為氯霉素工藝過(guò)程控制和質(zhì)量保障提供參考依據(jù)。
總結(jié)
基因毒性雜質(zhì)分析是藥物開(kāi)發(fā)過(guò)程中極具挑戰(zhàn)性的方面，需要在患者用藥的安全性與研究周期、資源投入之間找到一個(gè)合適的平衡點(diǎn)，以便快速將藥物推向市場(chǎng)。如本文所示，某一特定類型的基因毒性雜質(zhì)通?？勺裱渥陨硖匦蚤_(kāi)發(fā)出多種分析方法。由于基因毒雜質(zhì)低限度水平的分析需求，更復(fù)雜的儀器和樣品制備過(guò)程變得更加普遍；與此同時(shí)，也更加需要知識(shí)經(jīng)驗(yàn)豐富的熟練的分析化學(xué)家來(lái)操作這些復(fù)雜的方法并合理地分析數(shù)據(jù)。由此可見(jiàn)，只要藥物的研發(fā)與生產(chǎn)不停發(fā)展，遺傳毒性雜質(zhì)分析的需求和發(fā)展也將永無(wú)止境。
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