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背景

BET蛋白家族包含四個異構(gòu)體：BDR2、BDR3、BDR4、BDET。每個BET蛋白均包含兩個溴結(jié)構(gòu)域——N末端BD1和C末端BD2。泛BET抑制劑同時作用于四個BET蛋白的兩個溴結(jié)構(gòu)域，其顯著的抗癌和抗增殖活性已經(jīng)得到充分證明。實際上，大量的的泛BET抑制劑已經(jīng)進入臨床I//II期用于癌癥治療。然而泛BET抑制劑也有眾多的副作用被報道。

 

由于四個亞型之間高度同源性，發(fā)現(xiàn)高亞型選擇性的BET抑制劑極具挑戰(zhàn)，然而BD1和BD2之間的同源性是更低的（靠近乙?；嚢彼嶙R別口袋的關(guān)鍵殘基改變導(dǎo)致），因此可能實現(xiàn)BD2選擇性。

 

到目前為止，尚未見高選擇性的BD2抑制劑報道，RVX-208BD2對BD1的選擇性大約30倍，GSK340選擇性稍高(BRD4 BD1 Kd=1.1μM，BRD4 BD2 Kd=7nM)。ABBV-744為nM級的BD2抑制劑，正在臨床前研究，具有290倍的選擇性（BDR2/3/4, BD2 vs BD1）。

 

BD2選擇性抑制劑用以理解BD2的體內(nèi)生物學(xué)功能及為后續(xù)高選擇性體內(nèi)有效的BD2抑制劑的發(fā)現(xiàn)奠定基礎(chǔ)。

 

苗頭化合物

研究者首先對超過200萬個化合物進行高通量篩選，為了篩選出僅僅結(jié)合BD2的小分子，將BD1乙酰賴氨酸結(jié)合位點的保守酪氨酸突變?yōu)楸彼?Y97A)，使其結(jié)合位點失活，從而僅僅保留BD2具有結(jié)合活性（Y390A突變用于測試BD1活性）。最終得到1作為苗頭化合物。

優(yōu)化基礎(chǔ)

為了進一步理解1的選擇性，研究者獲得了其與BRD4 BD1及BRD2 BD2結(jié)構(gòu)域的共晶結(jié)構(gòu)?；衔?包含與對乙酰氨基酚相似的乙?；嚢彼崮M母核，其結(jié)合模式與已經(jīng)發(fā)表的撲熱息痛在BRD2 BD1溴域的結(jié)合模式非常相似。N-乙?；７陆M蛋白尾部乙?；馁嚢彼?，其羰基與保守的天冬氨酸（BRD4 BD1 Asn140）形成氫鍵，保守的水分子網(wǎng)絡(luò)位于結(jié)合位點的底部。3位的末端苯環(huán)深入Ile146和Trp81-Pro82-Phe83形成的疏水口袋，1位的NH與Asn140形成水介導(dǎo)的氫鍵相互作用，此外，咪唑也與Asp96形成水介導(dǎo)的氫鍵網(wǎng)絡(luò)。

 

1與BRD2 BD2的結(jié)合模式與BRD4 BD1類似，這類結(jié)合模式在泛BET抑制劑中很常見。小分子在BD2與BD1結(jié)合構(gòu)象的不同在于咪唑的空間構(gòu)象，咪唑臨近的His433也存在兩個旋轉(zhuǎn)異構(gòu)狀態(tài)。在一個反式旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體中，組氨酸側(cè)鏈指向抑制劑，并允許兩個水分子進入口袋界面，而在另一個旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體狀態(tài)下，側(cè)鏈指向抑制劑并置換這些水分子。

優(yōu)化

因為堿性的氨基咪唑可能限制其透膜性，因此首先的SAR研究聚焦于酰胺咪唑部分，旨在提高其透膜能力。

 

其中，反式環(huán)己醇14提供了一個在效價、選擇性、溶解度和滲透率方面具有良好平衡的化合物。

 

接下來研究者固定丙胺酰胺基團（早期研究中發(fā)現(xiàn)丙胺酰胺基團具有良好的效力、LE和選擇性），對芐基苯部分進行SAR研究，結(jié)果顯示在芐基的α位引入甲基，大大提高了活性和選擇性，并保留了LE。

 

并且發(fā)現(xiàn)S對映體比相應(yīng)的R對映體活性更高。

 

將兩次優(yōu)選的取代基組合得到化合物29，其顯示了較好的BD2活性（將近100nM），杰出的選擇性（250倍），并且保留了苗頭化合物優(yōu)秀的理化性質(zhì)，在系列化合物中具有最佳的整體屬性。

 

遺傳毒性的避免

化合物29包含一個乙酰苯胺結(jié)構(gòu)，在體內(nèi)可能會由于脫乙酰作用形成一個誘變的氮鎓離子進而引發(fā)遺傳毒性。代謝研究也確認46為脫乙酰的主要代謝產(chǎn)物。此外，化合物29在酸性條件下（2M HCl,24h）芐基將脫去，得到含有苯酚結(jié)構(gòu)的47。

 

為了預(yù)測代謝中間體46及潛在的解離\代謝中間體47的的誘變性，應(yīng)用eHOMO進行半經(jīng)驗計算。計算結(jié)果表明（結(jié)果＞−0.320為Ames陽性）。降解/代謝中間體47具有最高的Ames陽性結(jié)果風(fēng)險。進一步的Ames試驗也證明了該計算結(jié)果。以上表明化合物26由于潛在的代謝/降解中間體47，推進臨床具有巨大的風(fēng)險。

 

 

降低誘變風(fēng)險的一個方法是通過在芳香母核引入吸電子基團降低苯胺的電子密度。

 

正如假設(shè)，在母核的各個位置引入F，得到了陰性的Ames檢測結(jié)果。

為了簡化合成工作，將環(huán)己醇替換為乙基，在系列F取代的化合物中發(fā)現(xiàn)6F取代的化合物52是最佳的，BD2活性提高接近5倍。將優(yōu)選的F取代和之前優(yōu)化的環(huán)己醇組合，最終得到優(yōu)選化合物59。

 

結(jié)果

59對BET家族具有杰出的選擇性，對非BET溴結(jié)構(gòu)域無明顯活性。

在LPS刺激的外周血單核細胞測試中，59抑制MCP-1（單核細胞趨化蛋白1，炎癥相關(guān)）產(chǎn)生（pIC50=7.5），這不僅證明了59的細胞滲透性，同時也證明了BD2抑制劑也具有一定的抗炎潛力。

 

化合物59在大鼠和狗中顯示了中等清除率，可接受的生物利用度，這些體內(nèi)數(shù)據(jù)顯示化合物59在動物模型中可作為一個合適的體內(nèi)探針。

 

選擇性的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)

 

59與BRD2 BD2及BRD4 BD1的共晶結(jié)構(gòu)顯示，該小分子的結(jié)合模式與1是相似的，4-乙酰氨基占據(jù)了乙?；馁嚢彼峥诖⑶遗c保守的W1水分子形成氫鍵相互作用。芐氧基占據(jù)了Val435及Trp370形成的口袋。

 

由于F原子與乙酰胺的靜電排斥，化合物59乙酰胺部分相對于化合物1具有更多的扭轉(zhuǎn)。這樣的扭轉(zhuǎn)迫使芐基更加靠近His433的側(cè)鏈，進而形成變對面的相互作用，同時迫使酰胺的NH更靠近Asn429的羰基氧，增強氫鍵相互作用。而環(huán)己醇與Pro430及His433形成主要的疏水相互作用。

 

59與BRD4 BD1及BRD2 BD2的結(jié)合是相似的，選擇性（BD2 vs BD1）的實現(xiàn)主要由于BD2中與His433(芐基/環(huán)己醇)及Pro430(芐基)更強的相互作用。

 

總結(jié)

 

泛BET抑制劑與BET蛋白家族的8個溴域具有同等的相互作用，并在許多體外表型分析和炎癥或腫瘤學(xué)的臨床前模型中顯示出了顯著的效果。大量的BET抑制劑已經(jīng)推進臨床，然而大多存在不良反應(yīng)。為了更好的理解每個結(jié)構(gòu)域?qū)ζ湫ЯΦ呢暙I并提高藥物安全性，選擇性的BET抑制劑亟待發(fā)展。

 

參考文獻

Alex Preston, et al.Design and Synthesis of a Highly Selective and In Vivo-Capable Inhibitor of theSecond Bromodomain of the Bromodomain and Extra Terminal Domain Family ofProteins. J. Med. Chem. 2020, 63, 17, 9070–9092.