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目前上市銷售的化學(xué)藥品已經(jīng)超過4000種，許多相似結(jié)構(gòu)藥物的藥理作用卻完全不同。因此，無論是藥品生產(chǎn)企業(yè)還是藥品檢驗(yàn)檢測機(jī)構(gòu)，根據(jù)藥品標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行檢驗(yàn)的首要問題是鑒別真?zhèn)?，以防止由于藥品生產(chǎn)和流通的各個環(huán)節(jié)發(fā)生差錯而導(dǎo)致藥物被誤用。

一、HPLC在鑒別中的應(yīng)用概述

      采用HPLC法進(jìn)行鑒別，除另有規(guī)定外，通常是對含量測定項(xiàng)下供試品溶液色譜圖中藥物主成分峰與相應(yīng)對照品溶液色譜圖中的主成分峰的保留時間進(jìn)行比較，保留時間應(yīng)一致。高效液相色譜法中，最常用的檢測器為紫外-可見分光檢測器，紫外檢測器的標(biāo)準(zhǔn)配置為多波長檢測器或二極管陣列檢測器(簡稱DAD，有些儀器公司又稱之為PDA)，采用DAD檢測器可對供試品和對照品色譜峰的紫外吸收光譜進(jìn)行比較，使鑒別更可靠，越來越多的企業(yè)開始采用HPLC-DAD法同時進(jìn)行色譜鑒別和紫外光譜鑒別，即供試品溶液主峰的保留時間及紫外吸收光譜應(yīng)與對照品溶液主峰的保留時間及紫外光譜一致。

     《美國藥典》(簡稱USP)通則＜621>指出色譜分析中的保留時間代表了該化合物的一個特征，但不是唯一特性，供試品與對照品保留時間的一致可以用來判定這兩種物質(zhì)是否相同的一個方面，但不足以確定這兩種物質(zhì)的同一性，某些物質(zhì)的保留時間可能在每張色譜圖中都有所差異。各國藥典對HPLC法鑒別的規(guī)定都是供試品溶液中主峰的保留時間應(yīng)與對照品溶液主峰的保留時間一致，但都未對一致的程度做出具體規(guī)定。如果認(rèn)為保留時間差異較大，可通過比較色譜峰的紫外光譜以確定兩者是否為同一化合物或采用向供試品溶液中加入對照品，應(yīng)只出現(xiàn)一個主峰的方法來確定是否為同一化合物。

二、HPLC法應(yīng)用于鑒別時要注意的問題

     理論上，同一物質(zhì)在相同的色譜系統(tǒng)中其色譜行為應(yīng)完全一致，可在實(shí)際工作中通常發(fā)現(xiàn)保留時間并不能完全一致，會有一定的波動和漂移。導(dǎo)致波動和漂移的因素有很多，較為常見的主要有以下幾種。

(一)柱平衡

     流動相組成或溫度變化時，色譜柱在新條件下再平衡需要一定的時間，在色譜柱達(dá)到完全平衡前不應(yīng)進(jìn)樣。在反相色譜中，色譜柱很快即可達(dá)到平衡，通常用10～20個柱體積的流動相沖洗或運(yùn)行20～30分鐘即可；但在離子對色譜中，一般離子對試劑的濃度都非常低，為使其在色譜柱上達(dá)到平衡，需延長平衡時間，極端情況下可能需要幾百毫升的流動相方能達(dá)到平衡。用硅膠柱作正相分離時常有保留時間突然改變的情況，其原囚是硅膠表面吸附的水含量的影響，流動相發(fā)生改變時相應(yīng)地改變了水的含量，使硅膠柱的含水量發(fā)生變化，溶解在流動相中的水對正相色譜的保留時間的影響很大，因?yàn)樗谡嗌V常用的流動相(如正己烷、二氯甲烷等)中的溶解度非常低，所以色譜柱的平衡通常需要很長時間；如用無水流動相，幾乎不可避免地從空氣中吸收水分，引起硅膠柱表面吸附水含量的上升，最好的辦法是在流動相中加入一定量的水，使色譜柱上水的含量維持恒定。

(二)低濃度強(qiáng)吸附組分

      強(qiáng)吸附組分可能永久地鍵合于色譜柱填料上，或者與填料表面發(fā)生化學(xué)附著，鍵合相也有可能被部分地去掉，從而引起保留時間的變化，在此情況下可用保護(hù)柱或用強(qiáng)流動相沖洗(反沖更為有效)去掉強(qiáng)吸附組分。低濃度強(qiáng)吸附組分可能由流動相引入，也有可能由樣品中帶入，后者在藥物分析中尤為常見。目前藥物制劑的劑型很多，《中國藥典》2015年版收載有38種劑型，其中每個劑型又有分類，即使是同品種制劑，不同企業(yè)產(chǎn)品中的輔料也不盡相同，因此在鑒別中要考慮輔料對試驗(yàn)可能的影響或干擾。

(三)分離條件發(fā)生變化

      分離條件的變化主要包括流速、流動相組成、溫度等的改變。流速的偶然波動通常是由于泵的問題引起，如存在氣泡，但在該情況下，樣品間的保留時間比是恒定的；流動相組成的改變可能是由于在線混合泵失靈引起的比例誤差，亦有可能是流動相長時間放置后組分發(fā)生了改變，后者尤為常見，尤其在使用揮發(fā)性溶劑時，真空脫氣引起揮發(fā)性組分的損失；如色譜柱上未安裝恒溫裝置或安裝了恒溫裝置但未進(jìn)行控溫，在此情況下，當(dāng)觀察到所有色譜峰的保留時間發(fā)生連續(xù)變化時，可首先考慮環(huán)境溫度的變化是否引起了保留時間的變化，通常1℃的溫度變化可能導(dǎo)致保留時間產(chǎn)生1%～2％的漂移。

（四）其他

      除以上幾種常見的情況外，由于藥品的特殊性，在化學(xué)藥品的鑒別中還應(yīng)注意以下一些特殊情況。

     復(fù)方制劑，由于組分多樣性和輔料的添加，有時要采用兩種或更多的色譜條件進(jìn)行藥物鑒別。比如USP39中收載的含有17種維生素的復(fù)合維生素片劑，需要采用C18、C8、氨基柱和硅膠柱4個色譜系統(tǒng)進(jìn)行鑒別；對于各組分的紫外響應(yīng)不同，尤其是含量相差很大的復(fù)方制劑，為保證低含量藥物的檢出，在鑒別中常采用不同的檢測波長。比如復(fù)方布地奈德/富馬酸福莫特羅吸入粉霧劑，富馬酸福莫特羅的含量為4.5ug/吸，僅為布地奈德的1/40，布地奈德和富馬酸福莫特羅的出峰時間分別約為4分鐘和11分鐘，根據(jù)組分在流動相中的紫外吸收光譜采用不同的波長分別檢測布地奈德和富馬酸福莫特羅。

     除了選擇合適的檢測器和色譜柱外，樣品的處理中，最好采用流動相作為溶劑進(jìn)行樣品制備，對照品和樣品的溶劑系統(tǒng)應(yīng)盡量一致。比如雙氫青蒿素，采用乙腈和甲醇為溶劑時，色譜峰完全不同(圖14-4)。當(dāng)然也會有特殊的情況，如鹽酸氨溴索注射液有關(guān)物質(zhì)檢查，以流動相為溶劑時，雜質(zhì)B峰面積不斷增加，在8小時內(nèi)，峰面積由1814增加至11 289，而以甲醇作為溶劑時，雜質(zhì)B則不再增加，此時就不能再采用流動相為溶劑。

圖14-4 雙氫青篙素色譜圖(A以甲醇為溶劑，B以乙腈為溶劑）

色譜柱：Waters Symmetry Shield RP18150mm×4.6mm

流動相：乙腈-水(1：1)

檢測波長：216nm

       另外一些藥物是與有機(jī)酸結(jié)合的形式，常見的有機(jī)酸包括：枸櫞酸、酒石酸、馬來酸、甲磺酸、苯磺酸、萘磺酸、琥珀酸等，在采用HPLC法鑒別含有機(jī)酸鹽的藥物時，有機(jī)酸鹽的鑒別往往被忽略，如果在檢測波長下，該有機(jī)酸的響應(yīng)明顯，應(yīng)采用相應(yīng)的有機(jī)酸對照品或確切的對照物質(zhì)對藥品中的有機(jī)酸進(jìn)行鑒別。比如采用苯磺酸和雙羥萘酸對照品對苯磺酸氨氯地平、雙羥萘酸噻嘧啶中苯磺酸和雙羥萘酸色譜峰進(jìn)行確認(rèn)(圖14-5)。與主成分相比，一般情況下有機(jī)酸先出峰，比如雙羥萘酸嘧啶、枸櫞酸他莫昔芬、苯磺酸氨氯地平等藥品。但也不排除有機(jī)酸在主成分之后出峰現(xiàn)象，比如苯甲酸利扎曲坦。因此，在標(biāo)準(zhǔn)中應(yīng)注明出峰順序、相對保留時間以及有機(jī)酸與堿基藥物的分離度和峰型。

圖14-5 雙羥萘酸噻嘧啶液相色譜圖

1．雙羥萘酸；2.噻嘧啶

色譜柱：Waters Symmetry Spheri-10 ODS 250mm×4.6mm

流動相：乙腈-水-乙酸-二乙胺(94：2.5：2.5：1)

檢測波長：288nm

三  小結(jié)

由于HPLC法鑒別具有準(zhǔn)確性高、自動化程度高、樣品前處理簡單等優(yōu)點(diǎn)，且通常是在HPLC法含量測定/有關(guān)物質(zhì)項(xiàng)下即可完成，目前已成為各國藥典鑒別項(xiàng)的首選方法。