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隨著生命科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，PCR成為當(dāng)下“最熱”的檢測技術(shù)之一。許多生物實(shí)驗(yàn)室都會進(jìn)行PCR實(shí)驗(yàn)，正確掌握PCR的原理及檢測方法對我們的科研將是如虎添翼。

 

PCR (polymerase chain reaction)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，又稱體外DNA擴(kuò)增技術(shù)，在1985年由美國Cetus公司的Kary Mullis首創(chuàng)，可以將微量目的DNA片段擴(kuò)增一百萬倍以上。Kary Mullis本人因此獲1993年諾貝爾化學(xué)獎。

 

優(yōu)點(diǎn)：敏感度高、特異性強(qiáng)、產(chǎn)率高、重復(fù)性好以及快速簡便等，廣泛應(yīng)用于微生物學(xué)、考古學(xué)、 法醫(yī)學(xué)及體育等領(lǐng)域，并已普及到許多普通實(shí)驗(yàn)室, 大大簡化了傳統(tǒng)的分子克隆技術(shù)，從而比較容易地 對目的基因進(jìn)行分析、鑒定。

 

PCR的原理

用于擴(kuò)增位于兩段已知序列之間的DNA片段，類似于天然DNA的復(fù)制過程。以擬擴(kuò)增的DNA分子為模板，以一對分別與模板5'末端和3'末端互補(bǔ)的寡核苷酸片段為引物， 在DNA聚合酶的作用下，按照半保留復(fù)制的機(jī)制沿著模板鏈延伸直至完成新的DNA合成，重復(fù)這一過 程，即可使目的DNA片段得到擴(kuò)增。

PCR基本反應(yīng)步驟

擴(kuò)增的特異性取決于引物與模板DNA的特易結(jié)合，基本反應(yīng)步驟分三步：

 

1、變性(Denaturation)：

加熱使模板DNA雙鏈間的氫鍵斷裂而形成兩條單鏈。

94°C 30〃

 

2、退火(復(fù)性)(Annealling)：

突然降溫后模板DNA與引物按堿基配對原則互補(bǔ)結(jié)合，也存在兩條模板鏈之間的結(jié)合，但由于引物的高濃度，結(jié)構(gòu)簡單的特點(diǎn)，主要的結(jié)合發(fā)生在模板與引物之間。

55°C 30〃

 

3.延伸(Extension):

將反應(yīng)溫度調(diào)節(jié)到酶的最適溫度，在DNA聚合 酶、4種dNTPs及鎂離子等存在的條件下，以引物的3'端開始，結(jié)合單核昔酸，形成與模板鏈互補(bǔ)的新DNA鏈。

72°C 1〃

 

上述3步為一個循環(huán)，每經(jīng)過一個循環(huán)，樣本 中的DNA量應(yīng)該增加一倍，新形成的鏈又可成為新一輪循環(huán)的模板，經(jīng)過25?40個循環(huán)后DNA可擴(kuò)增106 ?109 倍。

 

 

PCR擴(kuò)增的特異性是由一對寡核苷酸引物所決定的。

 

反應(yīng)初期，原來的DNA擔(dān)負(fù)起使模板的作用，隨著循環(huán)次數(shù)的遞增，由引物介導(dǎo)延伸的 片段急劇增多而成為主要模板，最終的擴(kuò)增產(chǎn)物是介于兩種引物5'端之間的DNA片段。

 

PCR的成分和作用

1、緩沖液：

10~50 mM Tris- Cl (pH8.4)

維持Taq酶作用環(huán)境的偏堿性

25~50 mM KCl

促進(jìn)引物退火，＞50 mM會抑制Taq酶的活性。

100μg/ml牛血清白蛋白(BSA)

對酶有一定的保護(hù)性，如質(zhì)量不好將起相反的作用，建議使用乙?；腂SA。明膠、Tween-20、二硫蘇糖醇(DTT)也有類似作用。

 

2、MgCl2:

L5~2e0 mM

Taq酶具有Mg2+依賴性，顯著影響反應(yīng) 的特異性和擴(kuò)增片段的產(chǎn)量，過量能增加非特異擴(kuò)增并影響產(chǎn)率，過低則酶活性顯著下降。

 

3、dNTPs :

dATP、dGTP、dCTP、dTTP—底物

0.02 ?0.2 mM

dNTPs可與Mg2+結(jié)合，應(yīng)注意Mg2+濃 度與dNTPs濃度之間的關(guān)系，Mg2+濃度比 dNTPs 濃度高 0.2~2.5 mM。

過高：加快反應(yīng)速度，還可增加堿基的錯誤摻入率和室驗(yàn)成本。

過低：反應(yīng)速度下降，可提高實(shí)驗(yàn)的精確性。

 

4、引物(Primer-P):

預(yù)擴(kuò)增核酸片段兩端的已知序列，決定特異性。0.2~1 μM

偏高：非特異產(chǎn)物擴(kuò)增及錯配，增加引物之間形成引物二聚體，產(chǎn)量降低。

偏低：產(chǎn)量降低。

 

5、Taq DNA聚合酶：

耐高熱

0.5~5 U/100μL

1U/25~50μL

偏高：引物非特異產(chǎn)物的擴(kuò)增。

偏低：產(chǎn)物量降低。

 

6、模板DNA (Template)：

最低102~105 bpDNA片段，實(shí)際用量遠(yuǎn)遠(yuǎn) 超過此量，用量需在實(shí)驗(yàn)中摸索。1~5μL。

過高：非特異產(chǎn)物增加 

過低：產(chǎn)量降低

 

7、水：

去離子水，補(bǔ)足整個反應(yīng)體積。

 

PCR反應(yīng)條件優(yōu)化

1、變性溫度和時間：

保證模板DNA解鏈完全是保證整個PCR擴(kuò)增成功的關(guān)鍵。

 

加熱90~95°C, 30~60s，再復(fù)雜的DNA 分子也可變性為單鏈。根據(jù)模板DNA復(fù)雜程度，可以調(diào)整變性溫度和時間。一般情況下選擇90°C 30〃,可使各種復(fù)雜的DNA分子完全變性。

 

溫度過高或高溫持續(xù)時間過長，可對Taq酶活性和dNTP分子造成損害。

 

2、復(fù)性溫度和時間:

PCR擴(kuò)增特異性取決于復(fù)性過程中引物與模板的結(jié)合。

復(fù)性溫度的選擇，可根據(jù)引物的長度和G+C含 量確定，長度在15~25 bp之間時，復(fù)性溫度Tm=4(G+C)+2(A+T)計(jì)算得到，一般位于40~600°C，30~60s。

 

復(fù)性溫度越高，產(chǎn)物特異性越高。復(fù)性溫度越低，產(chǎn)物特異性越低。

一般情況下選擇55°C 30〃足以使引物與模板 之間完全結(jié)合。

 

3、延伸溫度和時間:

一般位于Taq酶最適作用溫度70~75°C之間。引物小于16個核苷酸時，過高的延伸溫度不利于引物與模板的結(jié)合，可以緩慢升溫到70~75°C。

 

延伸反應(yīng)時間，可根據(jù)待擴(kuò)增片段的長度而定，<1Kb, 1分鐘足夠；>1Kb需加長延伸時間，10Kb片段延伸時間可達(dá)15分鐘。

 

延伸時間過長可出現(xiàn)非特異擴(kuò)增，常用72°C 1〃。

 

4、循環(huán)數(shù):

其他參數(shù)選定后，PCR循環(huán)次數(shù)主要取決于模板DNA的濃度。

 

理論上說20?25次循環(huán)后，PCR產(chǎn)物的積累即可達(dá)到最大值，實(shí)際操作中由于每步反應(yīng)的產(chǎn)率不可能達(dá)到100%，因此不管模板濃度是多少，20~30次是比較合理的循環(huán)次數(shù)。循環(huán)次數(shù)越多，非特異擴(kuò)增增加。