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1 引言

生物活性分析（Bioassay）主要是指檢測生物藥物活性/效價（Potency）的方法，生物活性是生物藥至關(guān)重要的CQA（critical quality attribute），是確保藥物有效性的最重要指標。因為蛋白藥物/抗體結(jié)構(gòu)和活性的復雜性，生物活性分析一直是生物藥行業(yè)質(zhì)量分析中最具有挑戰(zhàn)性的工作，如何持續(xù)地獲得可靠和準確的結(jié)果是整個行業(yè)所需要突破和進化的。

2 生物活性分析開發(fā)的根據(jù)

穩(wěn)定的活性分析結(jié)果需要受控的環(huán)境、經(jīng)確認/校準的儀器、合格的試劑，經(jīng)驗豐富且理解細胞生物學、了解監(jiān)管要求和最新技術(shù)趨勢的分析人員，使用的分析方法需要經(jīng)過完整的開發(fā)、表征和詳細的方法學驗證（可參見GMP 6大原則，參考文獻1）。統(tǒng)計學分析（statistics）和風險管理RM（risk management）作為制藥行業(yè)質(zhì)量管理中廣泛使用的工具，在生物活性分析的開發(fā)、驗證和全生命周期（life-cycle）也能有效減少我們的工作量，提高數(shù)據(jù)的可靠性。

在生物活性分析的新方法開發(fā)中，面對新的活性藥物成分（API）或生物類似藥（biosimilarity）的復雜性質(zhì)和/或嚴苛的相似性指標考慮，更多地需要引入統(tǒng)計學方法來為流程化方法開發(fā)和申報資料提供可靠的數(shù)據(jù)區(qū)間和新的解決思路。一般來說，耐用性（robust）良好的生物活性分析對于表征和監(jiān)控產(chǎn)品活性至關(guān)重要，確保在存在變化的條件下依然能獲得穩(wěn)定的結(jié)果可以有效加速藥物的開發(fā)、申報和上市。

2.1 質(zhì)量源于設(shè)計（QbD）

質(zhì)量源于設(shè)計（QbD）和試驗設(shè)計（DoE）在生物活性分析中通常被用來研究方法的耐用性。DoE可以用來對API濃度、孵育時間、細胞密度、培養(yǎng)時間、顯色方式等進行組合設(shè)計，但由于生物活性分析存在較大的變異性，通常對于一個條件需要進行重復試驗以獲得重復性（repeatability）和準確度（accuracy），其應用于方法驗證的話則可能需要的試驗次數(shù)太多。

而結(jié)合分析方法質(zhì)量源于設(shè)計（AQbD）思維的DoE可以有效減少試驗次數(shù)，從而在方法開發(fā)階段通過設(shè)定符合質(zhì)量研究目標和方法，通過RM分析影響分析方法可靠性的參數(shù)，采取降低風險的措施，設(shè)置合理的設(shè)計空間，并通過方法驗證制定最終的控制空間。由于現(xiàn)實條件的限制，目前大多數(shù)的生物活性法方法開發(fā)中都很難執(zhí)行真正有效的AQbD，但在方法開發(fā)中引入AQbD進行方法的耐用性考察和驗證方案的設(shè)計對于方法的持續(xù)優(yōu)化、驗證和數(shù)據(jù)的可靠性都具有重要的意義。

2.2 統(tǒng)計學

在生物活性分析的參數(shù)選擇和考察中，除了常規(guī)的分析方法重復性、準確度的計算外，統(tǒng)計學可以劑量效應曲線在相似性判斷中起到重要的作用。如F-統(tǒng)計常用來判斷斜率的相似性（參考文獻3）。

近年來，USP中關(guān)于生物活性分析的章節(jié)1032、1033、1034正日益被用來指導生物活性分析的設(shè)計和開發(fā)。而在ChP 3531中，尼妥珠單抗生物學活性的測定中規(guī)定供試品和對照品的平行性假設(shè)需不被否定（P＞0.05）；在ChP 3535中，康柏西普相對結(jié)合活性的測定中規(guī)定標準品與待測樣品的上漸進線（四參數(shù)曲線的D值）比值為0.80~1.25，下漸近線（四參數(shù)曲線的A值）比值為0.60~1.67之間，標準品與待測樣品斜率（四參數(shù)曲線的B值）比值為0.80~1.25之間，前7個濃度點，兩重復孔OD值CV%不大于15%，實驗方為有效（參考文獻3）。這些試驗的可接受標準既代表了監(jiān)管機構(gòu)的強制要求，也要求我們在方法研究中盡可能地使用統(tǒng)計學根據(jù)以從大量隨機性的數(shù)據(jù)中獲得生物活性分析的規(guī)律。

3 生物活性分析驗證

3.1 生物分析方法的偏差來源

在生物活性分析的方法驗證中，多種因素導致的偏差會使方法驗證工作進行的相當困難。如在常用的基于細胞的生物學活性分析方法研究中，包括以下因素都會導致偏差產(chǎn)生，如（參考文獻1）：

細胞代次不同照成劑量效應曲線變化；

96孔板的邊緣孔液體蒸發(fā)，即邊緣效應；

96孔板中氧氣和二氧化碳的交換；

細胞培養(yǎng)箱溫場的不穩(wěn)定性和不均勻性導致96孔板內(nèi)產(chǎn)生溫差；

樣品制備、稀釋過程中導致板內(nèi)藥物濃度不一致，如多通道移液器各孔道的不一致性，槍尖殘液；

酶標儀讀數(shù)的偏差等。

因此，在生物活性分析的開發(fā)中需要考慮到這些因素，確保使用的儀器設(shè)備處于受控的狀態(tài)，從稀釋的均勻性，移液的一致性，樣品的排布進行綜合考慮，如在96孔板內(nèi)增加緩沖區(qū)以避免邊緣孔的蒸發(fā)，加用濕盒保持飽和濕度，規(guī)定移液方式、梯度稀釋混勻次數(shù)等多方面保證實驗的一致性（參考文獻4）。

3.2 生物活性分析的驗證設(shè)計

生物活性分析的方法驗證通常需要進行多次試驗以獲得足夠的數(shù)據(jù)對方法的各項參數(shù)進行分析。為達到驗證工作的合規(guī)性和工作量的合理性的平衡，除參考常規(guī)的分析方法驗證指南外（如ChP 9101），通?？稍诜椒炞C中對除專屬性以外的指標進行合并設(shè)計（準確度、精密度、線性和范圍）。在ChP 9401中，分別對基于細胞的體外生物學活性和基于動物的體內(nèi)生物學活性給出了示例（參考文獻3）：

在人粒細胞刺激因子生物學活性測定法（NFS-60細胞/MTT比色法，ChP 3525）驗證中，采取在對數(shù)尺度上呈均勻間隔的相對效價水平64%、80%、100%、125%、150%，每個效價水平由2名分析人員在不同日期使用4個細胞代次進行測定，通過合并設(shè)計得出相對準確度、中間精密度（重復性）、線性和范圍指標。

考察的統(tǒng)計學參數(shù)包括相對準確度（相對偏倚應應不大于±12%并報告期置信區(qū)間上限，且理論效價值與測定值的對數(shù)線性擬合斜率應在0.80~1.25之間）、中間精密度每個測定值的幾何變異系數(shù)（GCV）應不高于20%、線性（理論效價值與測定值的對數(shù)線性擬合相關(guān)系數(shù)應不低于0.98）、范圍（報告相對準確度、中間精密度和線性符合要求時的效價水平范圍，該范圍應至少涵蓋相對效價的質(zhì)量標準80~150%）。

在卵泡刺激素生物活性分析（ChP 1216，大鼠卵巢增重法）中，同樣對以上四項指標進行合并設(shè)計，選擇在對數(shù)尺度上呈均勻間隔的80%、100%、125%，每個效價水平獨立測試3次，四項指標參數(shù)與以上例子相同。

4 生物活性分析的生命周期管理

在驗證完成后生物活性分析就可以開始使用，但仍需要對其性能進行持續(xù)的監(jiān)控。最常用也是最簡單的監(jiān)控方法是選取適宜的參數(shù)進行統(tǒng)計過程控制（SPC）圖進行檢測，如標準品的劑量反應曲線和質(zhì)控品、樣品的效價測定值等（參考文獻3）。通過SPC圖可以有效識別到方法的漂移和波動，并應及時進行歸因分析，95%置信區(qū)間（95%CI）也有助于對混雜的數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計。

當藥品的生產(chǎn)工藝變更、制劑組方變更等發(fā)生時，應評估這些變更對方法造成的修訂和質(zhì)量標準的改變，重新進行完整的方法驗證或通過橋接將原始測定數(shù)據(jù)過度到修訂方法。此外，對于已驗證的方法發(fā)現(xiàn)其不適合設(shè)計的使用用途時，應及時開發(fā)更穩(wěn)定的生物活性分析以避免監(jiān)管機構(gòu)對于產(chǎn)品性質(zhì)的質(zhì)疑。

5 小結(jié)

生物活性分析通常是生物藥開發(fā)中的重要限制因素，需要在GXP的基本要求下，通過AQbD指導方法開發(fā)，通過RM識別方法的主要變異點，采用合適的統(tǒng)計學參數(shù)對結(jié)果進行分析和報告，并加強方法的生命周期管理，從而獲得持續(xù)穩(wěn)定的生物活性分析的數(shù)據(jù)，對于生物藥的申報和上市都能產(chǎn)生很好的促進作用。

參考文獻

1 Cheryl Scott, Laureen Little, Nadine Ritter and Michael Sadick. BioassayEvolution: Finding Best Practices for Biopharmaceutical Quality Systems.BioProcess Int. Janurary 2020.

2 Das RG, Robinson CJ. Assessing Nonparallelism in Bioassays: A Discussionfor Nonstatisticians. BioProcess Int. November 2008.

3 Chp 2020.

4 Neeley C. Reducing the Edge Effect. Accelerating Science 27 June 2016.