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抗體-藥物偶聯(lián)物（Antibody-Drug Conjugate,ADC）是一類將單克隆抗體（monoclonal Antibody, mAb）與小分子細(xì)胞毒性藥物（Drug）通過(guò)化學(xué)鍵（連接子，linker）共價(jià)結(jié)合的生物治療藥。ADC通過(guò)高特異性的單克隆抗體瞄準(zhǔn)腫瘤細(xì)胞表面的抗原，之后通過(guò)內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞，在溶酶體的作用下釋放對(duì)于細(xì)胞具有高活性的小分子腫瘤細(xì)胞毒性藥物，從而直接殺傷腫瘤細(xì)胞或誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡。目前已推向市場(chǎng)或在研的ADC藥物中所使用的細(xì)胞毒性藥物主要包括微管蛋白抑制劑（例如DM1，DM4，MMAE，MMAF等）和DNA損傷劑（例如阿霉素，卡奇霉素，PBD等）。這些小分子細(xì)胞毒性藥物產(chǎn)生細(xì)胞毒性的劑量比常規(guī)化療藥低1000倍左右，因此并不適合直接作為腫瘤治療藥物。而ADC藥物通過(guò)將這些強(qiáng)毒性小分子與能“精確制導(dǎo)”腫瘤細(xì)胞的單抗偶聯(lián)，就能將“火力”盡量集中在腫瘤細(xì)胞內(nèi)，降低對(duì)非腫瘤細(xì)胞的“誤傷”。

不同類別的ADC藥物由于偶聯(lián)位點(diǎn)和連接子的化學(xué)類型各有區(qū)別，其藥物-抗體比率（drug-to-antibodyratio ，DAR）有差別。而同一類ADC由于體內(nèi)的代謝與解偶聯(lián)（catabolism anddeconjugation）作用，每個(gè)藥物分子之間的DAR值也不同，一般分布在0到8之間，均值通常為4，即ADC藥物是非均一性的混合物。因ADC在結(jié)構(gòu)上的特殊性和復(fù)雜性，與傳統(tǒng)小分子藥物和單抗藥物相比，評(píng)估ADC藥物的PK就需要獨(dú)特且更加復(fù)雜的生物分析檢測(cè)方案。ADC的PK分析通常要檢測(cè)其三個(gè)關(guān)鍵成分：總抗體（total antibody），總ADC，以及游離的小分子細(xì)胞毒性藥物（free drug；含/不含linker）。對(duì)于ADC包含抗體的部分（包括ADC以及總抗體），研究者通常使用配體結(jié)合試驗(yàn)（Ligand-bindingassay，LBA）進(jìn)行定量分析，并依此評(píng)估ADC的有效性和靶向毒性。而對(duì)于ADC的安全性和穩(wěn)定性評(píng)估，即此類藥物在體內(nèi)循環(huán)中對(duì)于非腫瘤細(xì)胞的潛在毒性，則需對(duì)生物基質(zhì)樣品中游離的小分子細(xì)胞毒性藥物進(jìn)行定量分析。

穩(wěn)定性是ADC游離小分子細(xì)胞毒性藥物生物分析方法面對(duì)的第一個(gè)挑戰(zhàn)。為了保證生物基質(zhì)樣品檢測(cè)的可靠性和完整性，研究者除了要考慮小分子可能在較高溫度、不同pH條件、或在基質(zhì)中酶解而產(chǎn)生的不穩(wěn)定性，也要考察在一定濃度的母藥（即ADC）或含linker的小分子存在的條件下，在基質(zhì)樣品中不含linker的游離小分子的“穩(wěn)定性”。而這后一種情況若存在不穩(wěn)定性，則通常表現(xiàn)為游離小分子（不含linker）的濃度隨時(shí)間增長(zhǎng)或溫度升高而升高，與小分子由于自身的不穩(wěn)定性所導(dǎo)致的濃度下降剛好相反。這種導(dǎo)致小分子濃度升高的“不穩(wěn)定性”與ADC連接子的性質(zhì)相關(guān)。ADC連接子主要可分為可裂解和不可裂解兩類，而可裂解連接子主要包括對(duì)酶敏感、對(duì)酸不穩(wěn)定或?qū)入赘孰牟环€(wěn)定這三種。因此，研究者可以根據(jù)連接子和小分子本身的性質(zhì)提出應(yīng)對(duì)的穩(wěn)定性解決方案。例如：是否在樣品中添加緩沖試劑以控制pH或抑酶劑，在哪個(gè)階段添加（臨床采樣、第一次化凍或是樣品提取后），樣品提取時(shí)是否可置于室溫或是必須浸于濕冰浴中等。這些穩(wěn)定性考察實(shí)驗(yàn)包括且不限于全血穩(wěn)定性、實(shí)驗(yàn)臺(tái)（樣品前處理）穩(wěn)定性、儲(chǔ)存穩(wěn)定性、凍融穩(wěn)定性和樣品提取后的穩(wěn)定性。

ADC游離小分子細(xì)胞毒性藥物在生物基質(zhì)中濃度通常比較低，這是生物分析方法面對(duì)的另一個(gè)挑戰(zhàn)。例如在一項(xiàng)對(duì)8種MMAE ADC的PK研究中，在單次靜脈注射2.4 mg/kg的劑量之后，血漿中游離MMAE的濃度Cmax均比其相應(yīng)的ADC及總抗體的濃度低至少100倍，僅為不到10 ng/mL [DOI: 10.1080/19420862.2019.1699768]。這就意味著這類小分子基質(zhì)樣品的定量下限需要低至幾百甚至幾十pg/mL。生物基質(zhì)樣品中游離的小分子細(xì)胞毒性藥物的提取，一般可采用蛋白沉淀（proteinprecipitation, PPT）、液-液萃取（liquid-liquidextraction, LLE）、固相萃?。╯olid phaseextraction, SPE）等小分子生物分析常用的前處理方法。在基質(zhì)樣品量有限、以及通過(guò)前處理進(jìn)行濃縮的倍數(shù)僅能做有限調(diào)整的情況下，用于定量檢測(cè)的儀器的靈敏度就至關(guān)重要。液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（LC-MS/MS）由于具有高選擇性和高靈敏度的特性，是分析檢測(cè)生物基質(zhì)樣品中痕量游離小分子細(xì)胞毒性藥物的首選方式。值得一提的是，LC-MS/MS并不僅限于游離的小分子細(xì)胞毒性藥物的定量分析。當(dāng)采用了合適的、具有針對(duì)性的樣品前處理方法后，LC-MS/MS既可以用于定量生物樣品中游離的細(xì)胞毒性藥物，亦可同時(shí)對(duì)偶聯(lián)在抗體上的小分子（antibody-bounddrug）進(jìn)行定量分析；并且，在合適的免疫捕獲及酶解或化學(xué)水解處理之后，還能根據(jù)特征肽段對(duì)包含抗體的大分子部分進(jìn)行定量分析。例如，Pandey et al. [DOI: 10.1021/acs.analchem.9b04419]對(duì)血漿樣品先進(jìn)行蛋白沉淀并離心，之后分離上清（supernatant）和蛋白沉淀部分（protein layer）。上清在經(jīng)過(guò)了吹干、復(fù)溶和過(guò)濾等操作后，所得樣品溶液進(jìn)行LC-MS/MS分析，即可獲得非偶聯(lián)小分子及其葡萄糖醛酸代謝產(chǎn)物的血漿濃度。與此同時(shí)，研究者對(duì)蛋白沉淀部分進(jìn)行2小時(shí)、100℃的酸化水解處理，從而釋放偶聯(lián)在抗體上的小分子，之后新添加沉淀劑對(duì)水解樣品進(jìn)行提取，取其上清吹干、復(fù)溶和過(guò)濾之后，所得樣品溶液亦使用LC-MS/MS定量分析，可得偶聯(lián)小分子的血漿濃度。在另一篇文獻(xiàn)中，F(xiàn)aria et al. [DOI: 10.3390/antib8010011]使用LBA或SPE進(jìn)行樣品前處理，從而可用LC-MS/MS分別測(cè)定人血漿中（1）ADC總量（用酶解所得的小分子總量表示）和相應(yīng)的抗體總量（用酶解所得的特征肽段總量表示），（2）小分子去乙酰化的ADC總量以及相應(yīng)的抗體總量（樣品前處理方法同（1）），以及（3）非偶聯(lián)的小分子及其去乙?；a(chǎn)物。

Fig. LBA-LC-MS/MS同時(shí)測(cè)定ADC總量和抗體總量示例

在藥物研發(fā)過(guò)程中，生物分析對(duì)于大分子的藥代動(dòng)力學(xué)（PK）、藥效動(dòng)力學(xué)（PD）和安全性評(píng)價(jià)也是非常重要的，因此分為以下三個(gè)部分詳述。

1.     ADC 藥代動(dòng)力學(xué)（PK）的生物分析

藥明康德大分子生物分析實(shí)驗(yàn)室采用ELISA平臺(tái)來(lái)檢測(cè)大分子藥物藥代動(dòng)力學(xué)。主要方法是雙抗夾心法ELISA，即用抗ID（idiotype）試劑來(lái)捕獲抗體藥物，用HRP標(biāo)記的抗人IgG 或抗Fc抗體進(jìn)行定量檢測(cè)（顯色信號(hào)值）。對(duì)于ADC藥物的PK檢測(cè)，我們實(shí)驗(yàn)室采用不同的捕獲抗體和檢測(cè)抗體組合，來(lái)分別檢測(cè)ADC的不同組分（總抗體和抗體結(jié)合藥物）。下圖展示了常規(guī)大分子生物藥和ADC藥物的PK檢測(cè)方法：

A.     常規(guī)ELISA方法：捕獲試劑：抗ID（idiotype）試劑，檢測(cè)試劑：標(biāo)記的抗人IgG 或抗Fc抗體

B.     檢測(cè)ADC總抗體：捕獲試劑：抗ID（idiotype）試劑，檢測(cè)試劑：標(biāo)記的抗Fc抗體或者抗ID（idiotype）試劑

C.     檢測(cè)ADC抗體藥物復(fù)合物：捕獲試劑：抗小分子藥物抗體，檢測(cè)試劑：標(biāo)記的抗Fc抗體或者抗ID（idiotype）試劑。

ADC藥代動(dòng)力學(xué)PK檢測(cè)的挑戰(zhàn)：

1）與常規(guī)大分子抗體藥物PK檢測(cè)相比，ADC的PK ELISA檢測(cè)難以獲得特異性的捕獲和檢測(cè)試劑，多用到重組抗原、抗ID抗體或抗人IgG 抗體。但是即使采用了多種分析方法，ADC在體內(nèi)的生物轉(zhuǎn)化，仍會(huì)影響DAR的變化，進(jìn)一步導(dǎo)致了不同PK采樣時(shí)間點(diǎn)ADC混合物的動(dòng)態(tài)變化。由于ADC混合物的動(dòng)態(tài)變化，ELISA定量檢測(cè)所用的參考標(biāo)準(zhǔn)品可能不能完全反映樣品中的被檢測(cè)物的水平。

2）ADC藥物有其特殊性，比如ADC藥物結(jié)構(gòu)和工藝較為復(fù)雜，其連接分子類型、連接部位、抗體與小分子結(jié)合造成的聚合、裂解等都為ADC的藥代動(dòng)力學(xué)和毒理研究帶來(lái)挑戰(zhàn)。另外，不同的檢測(cè)方法和試劑也會(huì)對(duì)結(jié)果帶來(lái)預(yù)想外的結(jié)果。

近幾年來(lái)，藥明康德生物分析實(shí)驗(yàn)室開(kāi)展了多項(xiàng)ADC檢測(cè)服務(wù)項(xiàng)目。在實(shí)踐工作過(guò)程中，我們積累了不少有益的經(jīng)驗(yàn)。在為ADC項(xiàng)目制定生物分析策略時(shí)，我們首先對(duì)ADC的結(jié)構(gòu)、體內(nèi)轉(zhuǎn)化產(chǎn)物等做盡可能充分的了解，研究每個(gè)ADC藥物的具體特征和可能發(fā)生的聚合、裂解等，制定相應(yīng)的策略來(lái)優(yōu)化檢測(cè)手段，例如采用對(duì)應(yīng)于ADC的不同組分的捕獲試劑和檢測(cè)試劑，減少由于ADC藥物聚合或裂解所導(dǎo)致影響檢測(cè)結(jié)果的情況。

2.     ADC的免疫原性抗藥抗體（ADA）分析

和其他生物大分子藥物一樣，ADC在人體內(nèi)也可能會(huì)導(dǎo)致免疫原性，產(chǎn)生相應(yīng)的抗藥抗體（ADA），造成對(duì)PK，PD和安全性影響。藥明康德大分子生物分析實(shí)驗(yàn)室對(duì)ADA的分析方法主要是MSD平臺(tái)的橋聯(lián)（Bridging Assay）法。捕獲試劑為Biotin標(biāo)記的大分子藥物，檢測(cè)試劑為地高辛（DIG）或釕標(biāo)記的大分子藥物。

ADC的ADA分析流程與生物大分子藥物的ADA分析相同，包括1）篩選閾值（screening cutpoint），2）確證閾值（confirmatorycut point），以及3）鑒定ADA滴度（Titer）。

1） 篩選閾值為篩選試驗(yàn)的響應(yīng)水平，響應(yīng)值高于該閾值的樣品被認(rèn)為是潛在陽(yáng)性樣品，響應(yīng)值低于該閾值的樣品為陰性樣品。

2） 由于篩選閾值允許5%的假陽(yáng)性率，以上篩選試驗(yàn)篩選出的潛在陽(yáng)性樣品有可能是非特異性的。因此需要檢測(cè)藥物的特異性，即從潛在陽(yáng)性樣品中鑒定出陽(yáng)性樣品。特異性確證試驗(yàn)通常是一個(gè)競(jìng)爭(zhēng)性抑制試驗(yàn)，通過(guò)檢測(cè)不加入和加入研究藥物樣品時(shí)的信號(hào)值變化來(lái)進(jìn)行評(píng)估。

3） 對(duì)于高于確證閾值（陽(yáng)性樣本），需要鑒定ADA的效價(jià)。將陽(yáng)性樣本稀釋成一系列濃度，當(dāng)稀釋后樣品信號(hào)值大于或等于滴度閾值（titer cutpoint）時(shí)，此稀釋倍數(shù)即為ADA的效價(jià)。

針對(duì)ADC上不同表位的產(chǎn)生的的ADA ，抗原表位可以是在抗體部分，偶聯(lián)臂，或小分子藥物部分，也可以是復(fù)合物。根據(jù)FDA對(duì)抗藥抗體檢測(cè)指南的說(shuō)明，抗體-藥物偶聯(lián)物（ADC）是抗體與小分子藥物偶聯(lián)的復(fù)合物，它們代表了經(jīng)典的半抗原載體分子。因此，免疫原性測(cè)定應(yīng)分析對(duì)ADC治療性蛋白質(zhì)產(chǎn)品所有成分的反應(yīng)，包括抗體，連接藥物和可能由結(jié)合產(chǎn)生的新表位。所以針對(duì)ADC的ADA檢測(cè)，需要開(kāi)發(fā)能檢測(cè)這一系列抗體的方法，并且需要不同的陽(yáng)性抗體作為陽(yáng)性對(duì)照（PC）。

目前對(duì)于不同表位的分析實(shí)驗(yàn)有兩種方式來(lái)鑒別：1）競(jìng)爭(zhēng)性方法：將樣品和兩種標(biāo)記的ADC，與未標(biāo)記的過(guò)量的ADC中的抗體孵育一段時(shí)間，如果未標(biāo)記的抗體孵育后樣品的響應(yīng)水平的下降百分比高于方法驗(yàn)證中的閾值，則表明抗藥抗體來(lái)自ADC中的抗體。將樣品和兩種標(biāo)記的ADC與未標(biāo)記的過(guò)量的連接臂-小分子藥物同樣的孵育，可以鑒別出來(lái)自于連接臂-小分子藥物的抗體。2）檢測(cè)方法：將樣品和Biotin標(biāo)記的ADC藥物與釕標(biāo)記的抗體孵育，如果釕標(biāo)記的抗體孵育樣品的響應(yīng)高于方法驗(yàn)證中的篩選閾值，則表示ADA檢測(cè)信號(hào)值是由抗體產(chǎn)生的，同樣將樣品和Biotin標(biāo)記的ADC藥物與釕標(biāo)記的連接臂-小分子藥物孵育，可以鑒別出來(lái)自于連接臂-小分子藥物產(chǎn)生的抗體。

ADC分析項(xiàng)目，主要是采用競(jìng)爭(zhēng)法來(lái)鑒別針對(duì)ADC藥物上不同表位的ADA。在多個(gè)ADC藥物抗藥抗體分析的項(xiàng)目中，我們都成功開(kāi)發(fā)出敏感度好的方法有效地鑒別出了是否有針對(duì)單抗和針對(duì)抗體藥物復(fù)合物的抗藥抗體ADA的存在。

3.      ADC藥物的中和抗體（Nab）分析

對(duì)于抗藥抗體（ADA）陽(yáng)性的樣本，通常需要分析中和抗體（Nab）。中和抗體是抗藥抗體中的一類抗體，能夠通過(guò)直接與藥物作用結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合，或者通過(guò)空間位阻的作用，使藥物失去與其靶點(diǎn)結(jié)合的能力，從而封閉、中和藥物的治療活性。中和抗體的產(chǎn)生通常與血藥濃度降低，藥效降低，副作用的出現(xiàn)有著很強(qiáng)的關(guān)聯(lián)性，因此對(duì)機(jī)體在使用生物藥后產(chǎn)生的中和抗體檢測(cè)是免疫原性檢測(cè)中關(guān)鍵的一個(gè)部分。

目前針對(duì)免疫原性分析的相關(guān)法規(guī)中推薦1）cell-basedanalysis: 使用基于細(xì)胞的體外功能性試驗(yàn)來(lái)進(jìn)行中和抗體（Nab）的評(píng)價(jià)，或2）non-cell-basedanalysis: 對(duì)于某些生物藥物根據(jù)其作用機(jī)理可以選擇競(jìng)爭(zhēng)性配體結(jié)合試驗(yàn)（LBA）來(lái)進(jìn)行中和抗體（Nab）的評(píng)價(jià)。監(jiān)管機(jī)構(gòu)（FDA）更推薦使用cell-based，它更接近反映體內(nèi)的真實(shí)情況，難點(diǎn)是需要找到合適的細(xì)胞系，更長(zhǎng)時(shí)間的開(kāi)發(fā)、優(yōu)化和驗(yàn)證，變異大，基質(zhì)效應(yīng)明顯，干擾大。在難以獲得相關(guān)細(xì)胞系，或者基質(zhì)干擾無(wú)法解決，cell assay 的信號(hào)弱等情況下，可以選擇non-cell-basedanalysis，該方法簡(jiǎn)單，快速，而且更穩(wěn)健，靈敏度更高（可能）。與ADA分析不同的是，Nab分析的陽(yáng)性抗體需要有明顯的中和活性（單抗和多抗都可以）。