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在藥品生產(chǎn)、質(zhì)量保證 (QA) 和質(zhì)量控制 (QC)過程中，分析測試方法必須遵守國際標(biāo)準(zhǔn)。采用UV/Vis分光光度法進(jìn)行蛋白定量，是目前最常用的蛋白藥物定量方法之一，基本所有制藥企業(yè)的QC都有不止一套UV/Vis光譜儀/分光光度計，也都非常關(guān)注數(shù)據(jù)合規(guī)性，但關(guān)于紫外吸收蛋白定量數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性驗(yàn)證方法、影響數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性的因素 ，以及對正在“服役”的分析儀器是否符合藥典性能驗(yàn)證要求，如何驗(yàn)證等問題，相信很多人仍是一頭霧水。針對UV/Vis光譜儀作為分析工具的適用性驗(yàn)證，美國藥典（USP）42<857>章節(jié)和歐洲藥典（Ph.Eur.）第2.2.2.25節(jié)規(guī)定了性能測試方案和驗(yàn)證標(biāo)準(zhǔn)。本文我們就來?xiàng)l分縷析解讀藥典要求。

首先要清楚，USP 42<857> 和 Ph.Eur.2.2.2.25規(guī)定，應(yīng)對UV/Vis分光光度計在預(yù)期用途操作范圍內(nèi)進(jìn)行吸光度準(zhǔn)確性、精確性、線性、波長準(zhǔn)確性、分辨率和雜散光驗(yàn)證。然后我們再來解決一堆Why, What, How？

1. 吸光度準(zhǔn)確性(absorbance accuracy)

用吸光度值經(jīng)過認(rèn)證的標(biāo)準(zhǔn)品 ，對吸光度準(zhǔn)確性進(jìn)行驗(yàn)證，USP要求在0-2A之內(nèi)，至少驗(yàn)證1個吸光度值；而Ph.Eur.要求對預(yù)期吸光度范圍上下限值均需驗(yàn)證，可接受偏差應(yīng)該包含標(biāo)準(zhǔn)品生產(chǎn)不確定性偏差。

2. 吸光度精確性(absorbance precision)

Ph.Eur.第10版第2.2.2.25節(jié)對吸光度精確性無要求。USP 42<857>規(guī)定，如果標(biāo)準(zhǔn)值小于1A，則6次重復(fù)測定值的標(biāo)準(zhǔn)偏差（SD）應(yīng)等于或小于0.005 A。如果其大于或等于1A，則6次重復(fù)的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）必須小于或等于0.5%

3. 吸光度線性(absorbance linearity)

為滿足USP 42<857>的吸光度線性標(biāo)準(zhǔn)，線性吸光度范圍內(nèi)的3個具有不同吸光度水平的CRMs（認(rèn)證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)）必須全部通過準(zhǔn)確性和精確性測試。Ph.Eur.第10版第2.2.2.25節(jié)關(guān)于吸光度線性標(biāo)準(zhǔn)要求2個吸光度水平并且決定系數(shù)（R2）大于0.999。

根據(jù)USP 42<857>和Ph.Eur.2.2.2.25要求，需使用同一套CRMs對吸光度準(zhǔn)確性、精確性和線性進(jìn)行驗(yàn)證，重鉻酸鉀（K2Cr2O7）高氯酸（HClO4）溶液是USP和Ph.Eu.推薦的200–400 nm波長范圍內(nèi)UV/Vis分光光度計吸光度性能驗(yàn)證標(biāo)準(zhǔn)品。

UV/Vis分光光度計測定樣品在紫外和可見光范圍內(nèi)多波長吸光度，USP和Ph.Eur.規(guī)定所有UV/Vis分光光度計，必須驗(yàn)證波長準(zhǔn)確性和分辨率。

4. 波長準(zhǔn)確性(Wavelength accuracy)

UV/Vis分光光度計的波長準(zhǔn)確性是檢測儀器報告的波長與認(rèn)證波長之間的相近程度，可通過測量具有多波長明確峰值且可追溯的CRM吸收光譜，將測量光譜與已知光譜進(jìn)行比較來確定。

氧化鈥高氯酸溶液是一種國際公認(rèn)的固有波長標(biāo)準(zhǔn)溶液，其吸收峰值在241、287、361、537和641 nm，在USP 42<857>和第10版Ph.Eur. 第2.2.2.25條中均有認(rèn)定。根據(jù)USP和Ph.Eur.指南，200–400 nm之間波長驗(yàn)證標(biāo)準(zhǔn)為偏差在1 nm以內(nèi)，如果驗(yàn)證波長>400 nm，則偏差在2 nm以內(nèi)。

5. 波長分辨率(Spectral resolution)

光譜分辨率是指UV/Vis分光光度計正確區(qū)分吸收光譜中兩個相近波長吸光度的能力，可通過測量甲苯己烷溶液的吸收光譜，并確定最大吸光度（約269 nm）和最小吸光度（約266 nm）之間的比值考察。根據(jù)USP和Ph.Eur.標(biāo)準(zhǔn)，該比值不小于1.3。非廣告提醒：Big Lunatic每次測量前都會進(jìn)行波長自動校準(zhǔn)，所以可以確保良好的波長準(zhǔn)確性和分辨率。

6. 雜散光（Stray light）

雜散光是指由UV/Vis檢測器檢測到的不屬于指定波長的、“來路不明”的光，主要來源為內(nèi)部鏡面反射和二次衍射。雜散光在紫外波段的影響最大，而紫外波段也正是核酸和蛋白質(zhì)定量的最重要范圍。因此USP和Ph.Eur.要求，UV/Vis分光光度計必須確定其雜散光限值。USP推薦采用丙酮對250-330nm波長范圍進(jìn)行雜散檢測。Ph.Eur.指定使用碘化鈉、碘化鉀或亞硝酸鈉溶液來測試雜散光，但也允許其他標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。由于Ph.Eur.指定的標(biāo)準(zhǔn)溶液并不覆蓋核酸和蛋白最大吸收峰（分別為260和280nm），因此丙酮作為雜散光檢測參照物更合適。丙酮吸收250-330nm的大部分光，因此，通過UV/Vis分光光度計測量的該范圍內(nèi)的任何光都可能是雜散光。USP驗(yàn)證標(biāo)準(zhǔn)為吸光度大于或等于2A，而Ph.Eur.標(biāo)準(zhǔn)則要求吸光度≥3A(大于3A的吸光度相當(dāng)于小于0.1%的雜散光)。