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7月2日，國家藥品監(jiān)督管理局、國家衛(wèi)生健康委發(fā)布公告，正式頒布2020年版《中國藥典》，新版藥典將于今年12月30日起正式實施。新版《中國藥典》中對非無菌產品的微生物限度及檢查方法等都做出了相關要求，本文對其要點進行了整理，供大家參考。

 

供試品檢查

 

供試品的控制菌檢查應按經方法適用性試驗確認的方法進行。

 

（1）陽性對照試驗

陽性對照試驗方法同供試品的控制菌檢查，對照菌的加量應不大于100cfu。陽性對照試驗應檢出相應的控制菌。

 

（2）陰性對照試驗

以稀釋劑代替供試液照相應控制菌檢查法檢查，陰性對照試驗應無菌生長。如果陰性對照有菌生長，應進行偏差調查。

 

耐膽鹽革蘭陰性菌（Bile-Tolerant  Gram-Negative  Bacteria）

 

（1）供試液制備和預培養(yǎng)

取供試品，用胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基作為稀釋劑照“非無菌產品微生物限度檢查：微生物計數法（通則1105）”制成1∶10供試液，混勻，在20～25℃培養(yǎng)，培養(yǎng)時間應使供試品中的細菌充分恢復但不增殖（約2小時）。

 

（2）定性試驗

除另有規(guī)定外，取相當于1g或1ml供試品的上述預培養(yǎng)物接種至適宜體積（經方法適用性試驗確定）腸道菌增菌液體培養(yǎng)基中，30～35℃培養(yǎng)24～48小時后，劃線接種于紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上，30～35℃培養(yǎng)18～24小時。如果平板上無菌落生長，判供試品未檢出耐膽鹽革蘭陰性菌。

 

（3）定量試驗

1）選擇和分離培養(yǎng)

取相當于0.1g、0.01g和0.001g（或0.1ml、0.01ml和0.001ml）供試品的預培養(yǎng)物或其稀釋液分別接種至適宜體積（經方法適用性試驗確定）腸道菌增菌液體培養(yǎng)基中，30～35℃培養(yǎng)24～48小時。上述每一培養(yǎng)物分別劃線接種于紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上，30～35℃培養(yǎng)18～24小時。

2）結果判斷

若紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上有菌落生長，則對應培養(yǎng)管為陽性，否則為陰性。根據各培養(yǎng)管檢查結果，從表2查1g或1ml供試品中含有耐膽鹽革蘭陰性菌的可能菌數。

 

大腸埃希菌（Escherichia  coli ）

 

（1）供試液制備和增菌培養(yǎng)

取供試品，照“非無菌產品微生物限度檢查：微生物計數法（通則1105）”制成1∶10供試液。取相當于1g或1ml供試品的供試液，接種至適宜體積（經方法適用性試驗確定）的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，混勻，30～35℃培養(yǎng)18～24小時。

 

（2）選擇和分離培養(yǎng)

取上述培養(yǎng)物1ml接種至100ml麥康凱液體培養(yǎng)基中，42～44℃培養(yǎng)24～48小時。取麥康凱液體培養(yǎng)物劃線接種于麥康凱瓊脂培養(yǎng)基平板上，30～35℃培養(yǎng)18～72小時。

 

（3）結果判斷  

若麥康凱瓊脂培養(yǎng)基平板上有菌落生長，應進行分離、純化及適宜的鑒定試驗，確證是否為大腸埃希菌；若麥康凱瓊脂培養(yǎng)基平板上沒有菌落生長，或雖有菌落生長但鑒定結果為陰性，判供試品未檢出大腸埃希菌。

 

沙門菌（Salmonella）

 

（1）供試液制備和增菌培養(yǎng)

取10g或10ml供試品直接或處理后接種至適宜體積（經方法適用性試驗確定）的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，混勻，30～35℃培養(yǎng)18～24小時。

 

（2）選擇和分離培養(yǎng)

取上述培養(yǎng)物0.1ml接種至10ml RV沙門菌增菌液體培養(yǎng)基中，30～35℃培養(yǎng)18～24小時。取少量RV沙門菌增菌液體培養(yǎng)物劃線接種于木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養(yǎng)基平板上，30～35℃培養(yǎng)18～48小時。

 

沙門菌在木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養(yǎng)基平板上生長良好，菌落為淡紅色或無色、透明或半透明、中心有或無黑色。

用接種針挑選疑似菌落于三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基高層斜面上進行斜面和高層穿刺接種，培養(yǎng)18～24小時，或采用其他適宜方法進一步鑒定。

 

（3）結果判斷  

 

1）若木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養(yǎng)基平板上有疑似菌落生長，且三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基的斜面為紅色、底層為黃色，或斜面黃色、底層黃色或黑色，應進一步進行適宜的鑒定試驗，確證是否為沙門菌。

 

2）如果平板上沒有菌落生長，或雖有菌落生長但鑒定結果為陰性，或三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基的斜面未見紅色、底層未見黃色；或斜面黃色、底層未見黃色或黑色，判供試品未檢出沙門菌。

 

銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）

 

（1）供試液制備和增菌培養(yǎng)

取供試品，照“非無菌產品微生物限度檢查：微生物計數法（通則1105）”制成1∶10供試液。取相當于1g或1ml供試品的供試液，接種至適宜體積（經方法適用性試驗確定的）的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，混勻，30～35℃培養(yǎng)18～24小時。

 

（2）選擇和分離培養(yǎng)

1）取上述培養(yǎng)物劃線接種于溴化十六烷基三甲鏤瓊脂培養(yǎng)基平板上，30～35℃培養(yǎng)18～72小時。

2）取上述平板上生長的菌落進行氧化酶試驗，或釆用其他適宜方法進一步鑒定。

 

（3）氧化酶試驗

將潔凈濾紙片置于平皿內，用無菌玻棒取上述平板上生長的菌落涂于濾紙片上，滴加新配制的1%二鹽酸N，N-二甲基對苯二胺試液，在30秒內若培養(yǎng)物呈粉紅色并逐漸變?yōu)樽霞t色為氧化酶試驗陽性，否則為陰性。

 

（4）結果判斷

1）若溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養(yǎng)基平板上有菌落生長，且氧化酶試驗陽性，應進一步進行適宜的鑒定試驗，確證是否為銅綠假單胞菌。

 

2）如果平板上沒有菌落生長，或雖有菌落生長但鑒定結果為陰性，或氧化酶試驗陰性，判供試品未檢出銅綠假單胞菌。

 

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus  aureus）

 

（1）供試液制備和增菌培養(yǎng)

取供試品，照“非無菌產品微生物限度檢查：微生物計數法（通則1105）”制成1∶10供試液。取相當于1g或1ml供試品的供試液，接種至適宜體積（經方法適用性試驗確定）的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，混勻，30～35℃培養(yǎng)18～24小時。

 

（2）選擇和分離培養(yǎng)

取上述培養(yǎng)物劃線接種于甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基平板上，30～35℃培養(yǎng)18～72小時。

 

（3）結果判斷

若甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基平板上有黃色菌落或外周有黃色環(huán)的白色菌落生長，應進行分離、純化及適宜的鑒定試驗，確證是否為金黃色葡萄球菌；若平板上沒有與上述形態(tài)特征相符或疑似的菌落生長，或雖有相符或疑似的菌落生長但鑒定結果為陰性，判供試品未檢出金黃色葡萄球菌。

 

梭菌（Clostridia）

 

（1）供試液制備和熱處理

取供試品，照“非無菌產品微生物限度檢查：微生物計數法（通則1105）”制成1∶10供試液。取相當于1g或1ml供試品的供試液2份，其中1份置80℃保溫10分鐘后迅速冷卻。

 

（2）增菌、選擇和分離培養(yǎng)

1）將上述2份供試液分別接種至適宜體積（經方法適用性試驗確定）的梭菌增菌培養(yǎng)基中，置厭氧條件下30～35℃培養(yǎng)48小時。

 

2）取上述每一培養(yǎng)物少量，分別涂抹接種于哥倫比亞瓊脂培養(yǎng)基平板上，置厭氧條件下30～35℃培養(yǎng)48～72小時。

 

（3）過氧化氫酶試驗

取上述平板上生長的菌落，置潔凈玻片上，滴加3%過氧化氫試液，若菌落表面有氣泡產生，為過氧化氫酶試驗陽性，否則為陰性。

 

（4）結果判斷

1）若哥倫比亞瓊脂培養(yǎng)基平板上有厭氧桿菌生長（有或無芽孢），且過氧化氫酶反應陰性的，應進一步進行適宜的鑒定試驗，確證是否為梭菌.

 

2）如果哥倫比亞瓊脂培養(yǎng)基平板上沒有厭氧桿菌生長，或雖有相符或疑似的菌落生長但鑒定結果為陰性，或過氧化氫酶反應陽性，判供試品未檢出梭菌。

 

白色念珠菌（Candida albicans）

 

（1）供試液制備和增菌培養(yǎng)  

取供試品，照“非無菌產品微生物限度檢查：微生物計數法（通則1105）”制成1∶10供試液。取相當于1g或1ml供試品的供試液，接種至適宜體積（經方法適用性試驗確定）的沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基中，混勻，30～35℃培養(yǎng)3～5天。

 

（2）選擇和分離

1）取上述預培養(yǎng)物劃線接種于沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上，30～35℃培養(yǎng)24～48小時。

 

2）白色念珠菌在沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上生長的菌落呈乳白色，偶見淡黃色，表面光滑有濃酵母氣味，培養(yǎng)時間稍久則菌落增大，顏色變深、質地變硬或有皺褶。

 

3）挑取疑似菌落接種至念珠菌顯色培養(yǎng)基平板上，培養(yǎng)24～48小時（必要時延長至72小時），或釆用其他適宜方法進一步鑒定。

 

（3）結果判斷

1）若沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上有疑似菌落生長，且疑似菌在念珠菌顯色培養(yǎng)基平板上生長的菌落呈陽性反應，應進一步進行適宜的鑒定試驗，確證是否為白色念珠菌。

 

2）若沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上沒有菌落生長，或雖有菌落生長但鑒定結果為陰性，或疑似菌在念珠菌顯色培養(yǎng)基平板上生長的菌落呈陰性反應，判供試品未檢出白色念珠菌。