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嘉峪檢測網(wǎng) 2020-10-22 08:57
國際人用藥物注冊技術(shù)協(xié)調(diào)會議（ICH）Q3D元素雜質(zhì)指南對元素雜質(zhì)的分類、制劑日允許暴露量與濃度限度之間的轉(zhuǎn)換等做了詳細(xì)闡述，有利于幫助藥企通過風(fēng)險(xiǎn)評估來決定對哪些元素進(jìn)行額外控制，為藥品制訂合理的元素限度[1]。2017年6月中國獲得批準(zhǔn)正式加入ICH，這意味著中國的藥品監(jiān)管也將逐步轉(zhuǎn)化和實(shí)施國際ICH 的標(biāo)準(zhǔn)和指南，同時提高了我國各類化學(xué)藥品申報(bào)的標(biāo)準(zhǔn)?！吨袊幍洹?020版通則增修自2018年8月起已經(jīng)發(fā)布了十五批修訂公示，2018年12月28日發(fā)布的第三批公示包含了元素雜質(zhì)限度和測定指導(dǎo)原則（第一次征求意見稿）[2]，表明我國也將開始實(shí)施藥品中元素雜質(zhì)控制。
近年來發(fā)展迅速的電感耦合等離子體質(zhì)譜分析技術(shù)（ICP-MS）是元素分析領(lǐng)域非常先進(jìn)的技術(shù)，既可以定量測定元素含量，也可以定性分析元素種類，具有極低的檢出限，其可檢測的濃度能低至ng·kg-1級，較高的靈敏度和精密度、線性范圍寬、抗干擾能力強(qiáng)，并且能提供精確的同位素信息的分析特征等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于藥品行業(yè)中元素雜質(zhì)控制[3-7]。
方法學(xué)驗(yàn)證是對測定方法的評價，是建立新方法的研究內(nèi)容和依據(jù)。在藥品研發(fā)過程中需要根據(jù)產(chǎn)品的需求不斷調(diào)整和優(yōu)化檢測方法，并做出完整的方法學(xué)驗(yàn)證，證明該方法可以用于藥品的質(zhì)量控制。本研究結(jié)合現(xiàn)行版的美國藥典、歐洲藥典、《中國藥典》相關(guān)通則及相關(guān)文獻(xiàn)，探討并總結(jié)相對全面、科學(xué)的ICP-MS分析藥品中元素雜質(zhì)的方法要求。
如表1所示，美國藥典、歐洲藥典、《中國藥典》通則中均建立了ICP-MS儀器方法要求（USP40<730>Plasma Spectrochemistry[8]、EP9.2<2.2.58>Inductively Coupled Plasma-mass Spectrometry[9]，ChP2020<0412 >電感耦合等離子質(zhì)譜法[10]），此外，如表2所示，美國藥典、歐洲藥典通則中還單獨(dú)建立了藥品中元素雜質(zhì)殘留檢測方法要求（USP40<233>Elemental Impurities-Procedures[11]，EP 9.2<2.4.20>Determination of Metal Catalyst or Metal Reagent Residues[12]），目前中國藥典還沒有單獨(dú)建立藥品中元素雜質(zhì)殘留檢測方法要求，可以借鑒歐美藥典通則增訂適用于我國具體情況的相關(guān)通則。
表1 各國藥典通則ICP-MS儀器方法要求匯總
| 驗(yàn)證內(nèi)容 | USP<730> | EP <2.2.58> | ChP<0412 > |
| 系統(tǒng)適用性 | / |
1、儀器調(diào)諧，記錄靈敏度，短期和長期穩(wěn)定性，優(yōu)化儀器參數(shù)。2、對分辨率和質(zhì)量軸進(jìn)行調(diào)諧。3、評估等離子體分解氧化物的效率，使干擾最小化，Ce/CeO或Ba/BaO的比例<3%；用Ba和Ce減少雙電荷離子的形成，雙電荷離子的信號與指定元素的比值<2%。4、通過在樣品序列的最后運(yùn)行標(biāo)準(zhǔn)品來檢查長期穩(wěn)定性，控制錐體上的鹽沉積物是否在整個運(yùn)行期間降低了信號。 |
/ |
| 線性與范圍 | 類別1：居中100.0%濃度的驗(yàn)證范圍為80.0%~120.0%，相關(guān)系數(shù)r≥0.995；類別2：驗(yàn)證范圍為70.0%~130.0%，相關(guān)系數(shù)r≥0.99。 | 相關(guān)系數(shù)r≥0.99 | 相關(guān)系數(shù)r≥0.99 |
| 專屬性 | 方法應(yīng)該能夠確保在樣本中，每個元素都能被明確的檢測出。 | / | / |
| 檢測限 | / | / | 不少于7份空白樣品溶液，連續(xù)測定空白樣品溶液響應(yīng)值的3SD對應(yīng)的待測元素濃度。 |
| 定量限 | 定量限QL=10份空白溶液的標(biāo)準(zhǔn)偏差×10。應(yīng)至少能夠定量準(zhǔn)確分析至限度的50%。 | 定量限度低于限度值。 | 不少于7份空白樣品溶液，連續(xù)測定空白樣品溶液響應(yīng)值的10SD對應(yīng)的待測元素濃度。 |
| 準(zhǔn)確度 | 用標(biāo)準(zhǔn)溶液配制含50%~150%限度濃度目標(biāo)元素的標(biāo)準(zhǔn)溶液。類別1：平均回收率在95.0~105.0%之間；類別2：每個雜質(zhì)的三份不同濃度的元素回收率均在70%~150%之間。 | 含量測定：回收率范圍90%～110.0%；微量元素測定：回收率范圍80%～120.0%。 | / |
| 重復(fù)性 | 樣品溶液：6份樣品（相同批次），分別按限度加入標(biāo)準(zhǔn)元素雜質(zhì)。類別1：RSD應(yīng)不超過5%；類別2：每種元素雜質(zhì)的RSD應(yīng)不超過20%。 | 含量測定：RSD％≤3%;雜質(zhì)測定：RSD％≤5%。 | / |
| 中間精密度 | 不同的實(shí)驗(yàn)員，在不同的時間或用不同的儀器，按重復(fù)性測定（應(yīng)至少包括3個不同因素）。類別1：RSD應(yīng)不超過8%；類別2：每種元素雜質(zhì)的RSD應(yīng)不超過25%。 | / | / |
注：類別1：含量；類別2：定量雜質(zhì)及限度測定。
| 驗(yàn)證內(nèi)容 | USP<233> | EP <2.4.20> |
| 系統(tǒng)適用性 | 待測物漂移不大于20%。 | 分析當(dāng)天必須進(jìn)行系統(tǒng)適用性測試，以確保樣品制備和測量系統(tǒng)合適。 |
| 線性與范圍 | 滿足準(zhǔn)確度要求。 | 符合回收率要求。 |
| 專屬性 | 分析方法應(yīng)當(dāng)能夠明確檢測每種目標(biāo)元素(見USP<1225>Validation of Compendial Procedures[13])，共存的其他成分（包括其他目標(biāo)元素、基質(zhì)成分）不干擾檢測。 | 分析方法應(yīng)當(dāng)能夠明確檢測每種目標(biāo)元素，共存的其他成分（包括其他目標(biāo)元素、基質(zhì)成分）不干擾檢測。 |
| 檢測限 | / | 信號強(qiáng)度明顯區(qū)別于空白溶液，檢測限不超過限度值的0.5倍。 |
| 定量限 | 滿足準(zhǔn)確度要求。 | 定量限度低于限度值。 |
| 準(zhǔn)確度 | 三個不同濃度水平下加樣回收率平均值：70.0%～150.0% | 三個不同濃度水平下加樣回收率：70.0%～150.0%。 |
| 重復(fù)性 | 6個加標(biāo)樣品或3個濃度水平九份樣品RSD％≤20％。 | / |
| 中間精密度 | 不同儀器、不同分析人員、不同時間或其組合，與重復(fù)性共12次測定結(jié)果RSD％≤25%。 | / |
表2 各國藥典通則元素雜質(zhì)殘留檢測方法要求匯總
本次研究結(jié)合各國藥典相關(guān)通則及相關(guān)文獻(xiàn)，分別從系統(tǒng)適用性、線性與范圍、專屬性、檢測線與定量限、準(zhǔn)確度、精密度等方法要求對ICP-MS分析藥品中元素雜質(zhì)方法進(jìn)行討論，供行業(yè)內(nèi)參考。
1、系統(tǒng)適用性
EP<2.2.58>提出了對ICP-MS儀器分析較全面的系統(tǒng)適用性要求，包括儀器調(diào)諧要求及序列運(yùn)行穩(wěn)定性要求。儀器調(diào)諧要求包括儀器分辨率及質(zhì)量軸的調(diào)諧，并明確了調(diào)諧后靈敏度、雙電核、氧化物的要求。序列運(yùn)行穩(wěn)定性要求通過在樣品序列的最后運(yùn)行標(biāo)準(zhǔn)品來檢查長期穩(wěn)定性，控制錐體上的鹽沉積物是否在整個運(yùn)行期間降低了信號。USP<233>提出比較樣品序列運(yùn)行過程中分析樣品測定前后150%限度濃度對照品結(jié)果，測定元素雜質(zhì)信號的漂移，以控制整個運(yùn)行期間系統(tǒng)的穩(wěn)定性。根據(jù)各國藥典的要求，總結(jié)ICP-MS元素雜質(zhì)分析方法較全面的系統(tǒng)適用性要求為儀器開機(jī)后用調(diào)諧液調(diào)諧，配置好儀器參數(shù)，記錄儀器性能需符合藥典要求，樣品序列運(yùn)行過程中分別取150%限度濃度對照品溶液進(jìn)樣分析，信號漂移不得超過20%。
2、 專屬性
USP<730>、USP<233>、EP<2.4.20>規(guī)定分析方法應(yīng)當(dāng)能夠明確檢測每個目標(biāo)元素，共存的其他成分不干擾檢測，例如其他目標(biāo)元素、基質(zhì)成分等。上述藥典均未明確ICP-MS元素雜質(zhì)分析方法專屬性的具體做法。
ICP-MS分析過程中受到的干擾主要包括同質(zhì)異位素、多原子離子、雙電荷離子、物理干擾、基體效應(yīng)、記憶效應(yīng)等[10]。通過調(diào)研ICP-MS測定元素雜質(zhì)分析方法的文獻(xiàn)[14-17]，發(fā)現(xiàn)在方法建立或驗(yàn)證ICP-MS方法時進(jìn)行專屬性相關(guān)研究工作的較少，僅有少數(shù)研究者針對專屬性進(jìn)行了針對性的研究。成勇在微波消解-ICP-MS法測定二氧化鈦中痕量元素[18]研究中，系統(tǒng)地研究了H2SO4-HCl和HNO3-HF兩種消解消解體系，證明H2SO4-HCl消解體系對待測目標(biāo)元素產(chǎn)生較嚴(yán)重的多原子質(zhì)譜干擾，HNO3-HF消解體系不容易形成多原子干擾，不影響待測目標(biāo)元素測定；對基體元素Ti與消解試劑、Ar、O、H等ICP-MS中的主要元素結(jié)合所形成的多原子離子等質(zhì)譜干擾進(jìn)行了試驗(yàn)，研究出了鈦基多原子離子存在的主要潛在干擾，據(jù)此優(yōu)選不受其干擾的各待測元素的分析同位素，保證了方法的專屬性。DianePaskiet等探索三種不同pH萃取劑從彈性體膠塞中提取元素雜質(zhì)，以評估包材浸出至藥品中元素雜質(zhì)的風(fēng)險(xiǎn) [19]，研究過程中發(fā)現(xiàn)，由于萃取劑中含有鹽酸，待測目標(biāo)元素75As會受到40Ca35Cl和40Ar35Cl的多原子離子干擾。通過向ICP-MS儀器反應(yīng)池中引入氧氣，75As與16O可反應(yīng)生成質(zhì)量數(shù)為91的75As16O，40Ca35Cl和40Ar35Cl不與氧氣反應(yīng)，并保持質(zhì)量數(shù)為75，因此改為測定質(zhì)量數(shù)為91的75As16O代替As元素的測定，從而減少了多原子對待測目標(biāo)元素的干擾。
筆者針對ICP-MS分析過程中可能受到的干擾，對方法驗(yàn)證過程中專屬性內(nèi)容進(jìn)行了探討，可供同行業(yè)參考。（1）各待測元素均應(yīng)有各自的m/z，且待測元素的同位素之間不互相干擾檢測；若待測元素的同位素之間有重合，應(yīng)使用儀器校正方程自動修正。開發(fā)方法時根據(jù)樣品基質(zhì)含有的元素，考察可能的多原子干擾目標(biāo)待測元素情況。（2）空白溶液中待測元素的響應(yīng)值，干擾應(yīng)遠(yuǎn)低于限度濃度；（3）做外標(biāo)法時，對照品和樣品基質(zhì)如有差異，可能導(dǎo)致離子化效率不一致，應(yīng)考察基質(zhì)干擾對測定的影響，可采用以供試品溶液作為基質(zhì)，在基質(zhì)中加入限度濃度對照品，與相應(yīng)濃度對照品進(jìn)行比較，按下式方法計(jì)算基質(zhì)干擾，待測元素基質(zhì)抑制或增強(qiáng)均在一定范圍內(nèi)，說明基質(zhì)干擾較小，通過上述幾方面工作，可以證明專屬性良好。
式中：A為加標(biāo)供試品溶液中各元素雜質(zhì)響應(yīng)值(cps)；B為供試品溶液中各元素雜質(zhì)響應(yīng)值(cps)；C為限度濃度對照品溶液中各元素雜質(zhì)響應(yīng)值(cps)。
3、線性與范圍
結(jié)合各國藥典要求，對于低濃度，特別是微量元素分析，并且濃度范圍不大，檢測器響應(yīng)可靠，背景干擾較小，一般有3個濃度點(diǎn)（包括2點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)溶液及空白）即可。對于平時測量的樣品濃度范圍較寬，并且檢測器響應(yīng)不完全是一次曲線（直線）的，可以采用二次曲線或不分段校正方式，以減少數(shù)據(jù)偏差，數(shù)據(jù)點(diǎn)可以選擇4~6個。范圍應(yīng)包括樣品的最高、最低濃度且具滿足精密度、準(zhǔn)確度、線性的要求，可以設(shè)計(jì)為等比或等差濃度點(diǎn)。標(biāo)準(zhǔn)曲線應(yīng)該采用合適的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法，例如最小二乘回歸，各國藥典要求均為線性相關(guān)系數(shù)應(yīng)大于0.99。USP<730>對標(biāo)準(zhǔn)溶液的穩(wěn)定性做出了要求，用于微量分析的標(biāo)準(zhǔn)溶液的有效期是有期限的。一般取決于濃度、存儲容器的類型、存儲條件。由于這些原因，濃度小于10ppm(W/V)的標(biāo)準(zhǔn)溶液應(yīng)保留不得過24小時，除非另有驗(yàn)證數(shù)據(jù)證明其穩(wěn)定性。
4、檢測限與定量限
檢測限（LOD）是分析方法最重要參數(shù)之一，也是爭議較大的參數(shù)之一。調(diào)研國內(nèi)文獻(xiàn)[20-21]時，發(fā)現(xiàn)多數(shù)研究者對于空白樣品、測定次數(shù)及根據(jù)所需置信度選擇的系數(shù)要求不是很明確，筆者對LOD、定量限（LOQ）定義、計(jì)算公式、具體做法等來源進(jìn)行了調(diào)研[22]。
國際純粹與應(yīng)用化學(xué)聯(lián)合會（IUPAC）將檢出限定義為某特定方法在給定的置信度區(qū)間內(nèi)能夠合理地檢測出的最小分析信號求得的最低濃度[23]。檢出限的公式表示為：LOD = (kσB )/ S，其中k表示根據(jù)所需置信度選擇的系數(shù)，σB表示空白的標(biāo)準(zhǔn)偏差，S是該分析物的校準(zhǔn)曲線的斜率（即靈敏度）。Kaiser[24]認(rèn)為k取值3較為合適，因?yàn)檫@代表大多數(shù)應(yīng)用中計(jì)算的檢測限的95%置信區(qū)間，因此3是該計(jì)算中最常用的值。
AMC(Analytical Method Committee分析方法委員會)推薦計(jì)算LOD時空白測定應(yīng)不少于10次，建議使用真實(shí)空白，但在實(shí)際分析中很難得到，許多分析工作者使用試劑空白或接近空白代替。IUPAC建議σB應(yīng)通過實(shí)驗(yàn)以足夠多的測定次數(shù)求出, 如20 次；環(huán)境保護(hù)署（EPA）建議根據(jù)對目標(biāo)分析物空白樣品進(jìn)行7次重復(fù)分析，計(jì)算“方法檢出限”，其濃度為計(jì)算出的儀器檢測限濃度的2或3倍[25]。Chp<0412>規(guī)定LOQ為不少于7份空白樣品溶液，連續(xù)測定空白樣品溶液響應(yīng)值的3倍標(biāo)準(zhǔn)偏差對應(yīng)的待測元素濃度。
LOQ通常與LOD一起計(jì)算。LOQ是對LOD的保守估計(jì)，有時用作方法的報(bào)告限度[26]。對于每種分析物，LOQ代表可以足夠準(zhǔn)確地測量和報(bào)告的最低濃度。可以任意定義精密度和準(zhǔn)確度的理想水平，因此沒有用于計(jì)算LOQ的具體公式。但是，所需的精密度水平通常約為10％（報(bào)告為相對標(biāo)準(zhǔn)偏差），這意味著使用空白標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍來計(jì)算LOQ[27]。根據(jù)定義，LOQ不能低于LOD，并且不應(yīng)等于LOD。
5、準(zhǔn)確度
USP <730>、USP<233>、EP<2.4.20>、EP<2.2.58>規(guī)定在樣品消化或溶解之前，加入適量標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)制備3個不同濃度的溶液計(jì)算加樣回收率。根據(jù)歐美藥典要求，建議取9份供試品溶液，按50%、100%、150% 限度濃度分別加入標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，作為低、中、高3個不同濃度的加標(biāo)供試品溶液，每個濃度制備3個平行樣品，進(jìn)行加樣回收試驗(yàn)，驗(yàn)證方法準(zhǔn)確度。
6、精密度
6.1 重復(fù)性
參考USP <730>、USP <233>中已明確規(guī)定的重復(fù)性試驗(yàn)的做法。在6份樣品（相同批次）中分別按照限度濃度加入標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，對每種元素雜質(zhì)的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差進(jìn)行考察。
6.2 中間精密度
根據(jù)USP <730>、USP <233>規(guī)定中間精密度的考察應(yīng)至少包括不同的實(shí)驗(yàn)員、不同的時間、不同的儀器3個因素，可以3個不同因素或其不同因素的組合。例如，不同的實(shí)驗(yàn)員在不同的時間使用不同儀器進(jìn)行測定；或者同一實(shí)驗(yàn)員用一臺儀器分不同的3天分別測定；或者同一實(shí)驗(yàn)員分2天采用2套儀器分別測定；或者3個實(shí)驗(yàn)員用同一臺儀器分別測定，采用12次測定結(jié)果的RSD來驗(yàn)證中間精密度，每個待測元素相對標(biāo)準(zhǔn)偏差不超過25%（n=12）。
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來源：藥品研發(fā)驛站
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