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革蘭氏染色是一項(xiàng)經(jīng)典的細(xì)菌鑒別手段，自19世紀(jì)80年代丹麥的醫(yī)師GRAM創(chuàng)立起，至今已經(jīng)近一個(gè)半世紀(jì)，仍舊在細(xì)菌的檢測和鑒定分類上被廣泛應(yīng)用著。在我國，GB 4789系列的國標(biāo)中很多致病菌的檢測也都需要進(jìn)行革蘭氏染色，可見其重要性。甚至可以說沒有精準(zhǔn)掌握革蘭氏染色的微生物檢驗(yàn)員，不會是一個(gè)合格的檢驗(yàn)員。

 

革蘭氏染色原理

 

細(xì)菌先經(jīng)堿性染料結(jié)晶紫染色，而后經(jīng)碘液進(jìn)行媒染，之后用酒精脫色，在一定條件下有的細(xì)菌媒染后的顏色不被脫去，有的可被脫去，因此可把細(xì)菌分為兩大類，前者叫做革蘭氏陽性菌(G+),后者為革蘭氏陰性菌(G-)。為方便進(jìn)一步觀察，脫色后可再用一種紅色染料如堿性番紅等進(jìn)行復(fù)染。陽性菌仍帶紫色，陰性菌則被重新染上紅色。有芽孢的桿菌和絕大多數(shù)的球菌，以及所有的放線菌和真菌都呈革蘭氏正反應(yīng);弧菌、螺旋體和大多數(shù)致病性的無芽孢桿菌都呈現(xiàn)負(fù)反應(yīng)。

 

細(xì)菌細(xì)胞通過結(jié)晶紫初染和碘液媒染后，在細(xì)胞壁內(nèi)形成了不溶于水的結(jié)晶紫與碘的復(fù)合物，革蘭氏陽性菌由于其細(xì)胞壁較厚、肽聚糖網(wǎng)層次較多且交聯(lián)致密，故遇乙醇或丙酮脫色處理時(shí)，因失水反而使網(wǎng)孔縮小，再加上它不含類脂，故乙醇處理不會出現(xiàn)縫隙，因此能把結(jié)晶紫與碘復(fù)合物牢牢留在壁內(nèi)，使其仍呈紫色;而革蘭氏陰性菌因其細(xì)胞壁薄、外膜層類脂含量高、肽聚糖層薄且交聯(lián)度差，在遇脫色劑后，以類脂為主的外膜迅速溶解，薄而松散的肽聚糖網(wǎng)不能阻擋結(jié)晶紫與碘復(fù)合物的溶出，因此通過乙醇脫色后仍呈無色，再經(jīng)沙黃等紅色染料復(fù)染，就使革蘭氏陰性菌呈紅色。

 

革蘭氏染色法一般步驟

 

1.涂片固定。

 

在干凈的載玻片中央滴加一滴蒸餾水，用接種環(huán)進(jìn)行無菌操作，挑取培養(yǎng)物少許，置載玻片的水滴中，與水混合做成菌懸液并涂布成直徑約1cm的薄層。為避免因菌數(shù)過多聚集成團(tuán)，不利于觀察細(xì)菌個(gè)體形態(tài)，可在載玻片一側(cè)進(jìn)行上述操作，而在另一側(cè)再加一滴水，從已涂布的菌液中再取一環(huán)于此水滴中進(jìn)行稀釋，涂布成薄層。若材料為液體培養(yǎng)物或固體培養(yǎng)物中洗下制備的菌液，則直接涂布于載玻片上即可，如菌液濃度較大，也可使用水滴再進(jìn)行一次稀釋。

 

涂片最好在室溫條件下使其自然干燥，有時(shí)為了使之干得更快些，可將標(biāo)本面向上，手持載玻片一端的兩側(cè)，小心地在酒精燈火焰上方較高的位置微微加熱，使水分蒸發(fā)，但切勿緊靠火焰或加熱時(shí)間過長，以防標(biāo)本烤枯而變形。

 

標(biāo)本干燥后即進(jìn)行固定，固定的目的有三個(gè)：(1)殺死微生物，固定細(xì)胞結(jié)構(gòu)。(2)保證菌體能更牢固的粘附在載玻片上，防止標(biāo)本水洗時(shí)被水沖洗掉。(3)改變?nèi)玖蠈?xì)胞的通透性，因?yàn)樗赖脑|(zhì)比活的原生質(zhì)易于染色。

 

固定常常利用高溫，手執(zhí)載玻片的一端(涂有標(biāo)本的遠(yuǎn)端),標(biāo)本向上，在酒精燈火焰外層盡快的來回通過3-4次，共約2s-3s,并不時(shí)以載玻片背面加熱，載玻片背面觸皮膚，以不覺過燙為宜(不超過60℃),待放置冷后，再進(jìn)行染色。

 

2.染色。

 

在固定過的涂片菌膜上滴加草酸銨結(jié)晶紫染液，染色液應(yīng)完全覆蓋整個(gè)菌膜，染色1min。

 

3.水洗。

 

染色到一定的時(shí)間，拿住玻片使之成450角，用細(xì)小的水流把多余的染料沖洗掉，被菌體吸附的染料則保留。

 

4.媒染。

 

加碘液覆蓋涂面染1 min。在媒染處理時(shí)，媒染劑與染料形成不溶性的化合物，可增加染料和細(xì)菌的親和力。

 

5.水洗。

 

用細(xì)小的水流緩慢沖洗涂片上的染色液，用吸水紙吸干。

 

6.脫色。

 

加95%酒精數(shù)滴，并輕輕搖動進(jìn)行脫色，20s-30 s后再進(jìn)行水洗，吸去水分。

 

7.復(fù)染。

 

蕃紅染色液染色10 s后， 自來水沖洗。

 

8.干燥。

 

染色的結(jié)果，革蘭氏正反應(yīng)菌體都呈紫色，負(fù)反應(yīng)菌體都呈紅色。

 

影響染色結(jié)果準(zhǔn)確性的關(guān)鍵因素：

 

1.試劑影響。

 

這是我們首先應(yīng)該確保的，我們使用的試劑必須是有效的。實(shí)驗(yàn)室應(yīng)當(dāng)建立有效的試劑管理程序，從試劑的驗(yàn)收到存放、使用、過期后的廢棄處理都應(yīng)有嚴(yán)格規(guī)定，確保我們使用的試劑是有效的。工欲善其事必先利其器，這也是我們試驗(yàn)成功最基礎(chǔ)的一環(huán)。

 

2.染色菌的選擇。

 

菌齡對革蘭氏染色結(jié)果的影響是十分大的。我們?nèi)旧^程中選擇的菌應(yīng)該是處于活躍生長期，這樣的細(xì)菌活性強(qiáng)，生理特征明顯，所以染色的結(jié)果準(zhǔn)確度高，一般情況下不會出現(xiàn)誤差。培養(yǎng)時(shí)間較長的革蘭氏陽性菌，由于細(xì)胞老化，甚至有部分菌在染色之前就已經(jīng)死亡或者自行溶解了，造成細(xì)胞壁通透性增加，就會呈現(xiàn)出假陰性。以金黃色葡萄球菌為例，金葡是典型的革蘭氏陽性菌，有人曾經(jīng)統(tǒng)計(jì)過培養(yǎng)至不同時(shí)間的金葡的革蘭氏染色結(jié)果，結(jié)果表明，在金葡活躍期的22h-26h之間，染色結(jié)果的準(zhǔn)確率基本可以達(dá)到100%，而超過26h之后，準(zhǔn)確率就開始下降，培養(yǎng)至36h時(shí)，準(zhǔn)確率大概會下降30%左右。所以我們在染色時(shí)，一定要選擇處于活躍期、活性較強(qiáng)的菌落，在檢測過程中一定要嚴(yán)格的在國標(biāo)要求的時(shí)間段內(nèi)進(jìn)行染色試驗(yàn)，不能提前或者延后。

 

3.涂菌的狀態(tài)。

 

在染色最初的涂布中，在挑取菌體后應(yīng)該在無菌水上涂成薄薄的菌膜。而在涂布過程中，若是菌體堆積，也會極大影響染色結(jié)果的準(zhǔn)確性。菌落堆積過多，往往菌體之間變得毫無縫隙，而其細(xì)胞壁的成分影響造成了脫色的情況不佳，容易產(chǎn)生假陽性的結(jié)果。同時(shí)，在初染、媒染及復(fù)染的過程中，應(yīng)將染液覆蓋整個(gè)菌膜，避免一部分菌染色而另一部分菌沒有染色。因此在涂片過程一定要將菌膜涂得少而均勻，這樣才能達(dá)到最佳效果。

 

4.媒染時(shí)間。

 

媒染時(shí)間對革蘭氏陰性菌的染色結(jié)果有很大影響。由于媒染時(shí)間過長，結(jié)晶紫在碘液長時(shí)間作用下過分牢固結(jié)合在菌體細(xì)胞壁上，影響了酒精的脫色效果，從而會導(dǎo)致這種假陽性的效果。以典型的革蘭氏陰性菌大腸埃希氏菌為例，有人做過統(tǒng)計(jì)，媒染時(shí)間嚴(yán)格控制在40s-60s之內(nèi)，染色結(jié)果準(zhǔn)確率基本可達(dá)到100%，而超過60s準(zhǔn)確率會有一定的降低，若媒染超過100s，準(zhǔn)確率甚至可降低接近20%左右。因此在媒染過程中一定要注意媒染時(shí)間，控制在50-60s為宜。

 

5.酒精脫色。

 

酒精脫色也是一個(gè)對結(jié)果影響較大的操作過程。革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌最主要的差異是細(xì)胞壁肽聚糖層厚度和結(jié)構(gòu)，革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁肽聚糖層很薄，脂多糖含量高因此在酒精脫色時(shí)，細(xì)菌細(xì)胞壁的多糖成分會被酒精溶解，增大了細(xì)胞壁的通透性，結(jié)晶紫及碘復(fù)合物就很快被酒精洗脫，之后就會被沙黃復(fù)染呈紅色;而陽性菌肽聚糖層厚，脂多糖少，酒精只能起到脫水效果而無法進(jìn)入，這樣結(jié)晶紫和復(fù)合物就無法洗脫出來使細(xì)胞呈紫色。因此，酒精脫色時(shí)間短，脫色效果不佳，會導(dǎo)致陰性菌菌體內(nèi)的結(jié)晶紫和復(fù)合物不能有效的全部洗脫出來，就會出現(xiàn)明顯的誤差，使陰性菌出現(xiàn)假陽性。而洗脫時(shí)間過長，也會導(dǎo)致陽性菌的細(xì)胞壁被酒精破壞，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的紫色被洗脫，呈現(xiàn)假陰性。因此洗脫時(shí)間也是革蘭氏染色的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。洗脫時(shí)間應(yīng)當(dāng)嚴(yán)格控制在20s-30s之間，同時(shí)保證洗脫效果。

 

總結(jié)一下，在整個(gè)革蘭氏染色過程中，在保證試劑有效的前提下，需要嚴(yán)格控制的幾個(gè)方面：染色菌必須是在其活躍期內(nèi)，涂布狀態(tài)不可太厚，媒染時(shí)間嚴(yán)格控制在50s-60s之間，脫色時(shí)間嚴(yán)格控制在20s-30s。把握以上的關(guān)鍵控制點(diǎn)，革蘭氏染色基本就不會出現(xiàn)問題啦!