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降解試驗(yàn)?zāi)康?/span>

 

“Stability testing of New Drug Substances and Products” ICH Q1A (R2)要求，原料藥需進(jìn)行強(qiáng)制降解試驗(yàn)以闡明其結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，同時(shí)有助于識(shí)別其可能產(chǎn)生的降解產(chǎn)物。2015年，CFDA發(fā)布的《化學(xué)藥物(原料藥和制劑)穩(wěn)定性研究技術(shù)指導(dǎo)原則(修訂)》中指出，原料藥的穩(wěn)定性研究需進(jìn)行影響因素試驗(yàn)，即“通過(guò)給予原料藥較為劇烈的試驗(yàn)條件，如高溫、高濕、光照、酸、堿、氧化等，考察其在相應(yīng)條件下的降解情況，以了解試驗(yàn)原料藥對(duì)光、濕、熱、酸、堿、氧化等的敏感性、可能的降解途徑及產(chǎn)生的降解產(chǎn)物，并為包裝材料的選擇提供參考信息。”

 

強(qiáng)制降解實(shí)際情況

 

然而，指南中僅建議了溫度(如50度、60度)、濕度(如75%RH或更高)、光(參見ICH Q1B)的降解試驗(yàn)條件，對(duì)于酸、堿、氧化試驗(yàn)沒有做過(guò)多的描述。因此，在具體試驗(yàn)過(guò)程中，我們常常會(huì)有這樣的困惑：

 

1)什么樣的反應(yīng)物能有助于降解試驗(yàn)？

 

2)在進(jìn)行氧化降解時(shí)，什么樣的氧化劑最佳？

 

3)進(jìn)行酸降解時(shí)，能否使用硫酸代替鹽酸？

 

4)如果*前一次的降解試驗(yàn)沒有得到足夠的降解產(chǎn)物，那么，我們?cè)摬捎檬裁礃O端的條件以獲得足夠用于分離鑒別的降解產(chǎn)物？

 

5)是否有這樣或那樣的條件，我們滿足后就可停止或不需再進(jìn)一步的試驗(yàn)？

 

酸降解

 

在進(jìn)行酸降解時(shí)常用0.1N ~ 1.0N HCl，也有使用更濃的HCl；而除了使用鹽酸外，也有使用不同濃度硫酸作為酸降解試劑。同時(shí)，不同酸降解的反應(yīng)條件也是多種多樣，反應(yīng)溫度從40度到110度，甚者采用回流或沸騰條件，反應(yīng)時(shí)間也從1小時(shí)到2個(gè)月不等。有的藥物，如奧美拉唑，選用0.5N的硫酸回流5min即完全降解，而頭孢氨芐在同樣條件下一點(diǎn)沒有發(fā)生降解；有的藥物在0.1N鹽酸條件下回流1周也未發(fā)生降解。

 

堿降解

 

NaOH是常用的堿降解試劑，濃度從0.1N到1.0N不等，有時(shí)也使用KOH，但使用得比較少。與酸降解一樣，對(duì)于堿降解的反應(yīng)溫度變化也很大，從30度到100度甚至沸騰或回流。由于不同分子內(nèi)部結(jié)構(gòu)的差異，有些分子在0.1N氫氧化鈉條件下沸騰一周未發(fā)生降解，而有些分子如三氟拉嗪在0.1N氫氧化鈉、30度溫度下放置24小時(shí)即可發(fā)生完全降解。同理，當(dāng)使用1N的NaOH時(shí)，有些分子如雷尼替丁，沸騰20min即可降解至84.4%，而諾氟沙星在100度下進(jìn)行15小時(shí)也未發(fā)生降解。

 

氧破壞

 

在進(jìn)行氧破壞的氧化劑中，常用的氧化劑為雙氧水，濃度為1%到30%。有些藥物比較容易發(fā)生氧降解，如鹽酸雷尼替丁和鹽酸西咪替丁，使用3%的濃度在室溫下即可較快完成降解試驗(yàn)；而有的藥物如鹽酸舍曲林，在濃度為10%條件下回流6個(gè)小時(shí)也未發(fā)生一點(diǎn)的降解。這表明，有些藥物是易被氧化的，而有的藥物則不易被氧化，甚至使用更高濃度的氧化劑也不會(huì)氧化降解。

 

光降解

 

很多光降解試驗(yàn)表明，在進(jìn)行光降解時(shí)，光降解條件也非一成不變的。根據(jù)藥物特點(diǎn)，藥物可暴露于長(zhǎng)波長(zhǎng)或短波長(zhǎng)的紫外燈下，也可暴露于400-1580fc的日光燈下，試驗(yàn)溫度一般為室溫或接近室溫，試驗(yàn)周期為幾個(gè)小時(shí)到幾個(gè)月不等，依賴于光源強(qiáng)度。鹽酸西咪替丁在UV下進(jìn)行幾個(gè)月也未發(fā)生降解；維生素A酸在UV下2h即降解了一半。

 

決策樹

 

藥物分類

根據(jù)藥物的穩(wěn)定性情況，我們可以將它們分為六類：極不穩(wěn)定、很不穩(wěn)定、不穩(wěn)定、穩(wěn)定、非常穩(wěn)定、極度穩(wěn)定。

 

光降解中，根據(jù)ICH光降解條件將藥物分為兩類：對(duì)光敏感和對(duì)光不敏感，即如果藥物在ICH推薦的光條件下(1.2*106 lux h)能充分分解或完全降解，那么該藥物為對(duì)光敏感類藥物；否則，將總照度改為6.0*106 lux h。

當(dāng)我們拿到一個(gè)新藥物時(shí)，我們一般首先將它默認(rèn)為是第三類“不穩(wěn)定”藥物，然后根據(jù)反應(yīng)結(jié)果來(lái)判斷是否需要加大或弱化降解反應(yīng)條件。

 

酸/堿降解

 

為了研究藥物在酸/堿條件下的水解過(guò)程，我們可以先從0.1N HCl/NaOH回流8小時(shí)開始，認(rèn)為藥物是不穩(wěn)定的，見下圖決策樹：

如果能夠獲得足夠降解產(chǎn)物或者說(shuō)能達(dá)到試驗(yàn)?zāi)康?，那么就可不必再進(jìn)行深究試驗(yàn)；如果藥物沒有發(fā)生降解，則可以增加酸/堿的濃度，同時(shí)增加反應(yīng)時(shí)間；依次類推。如果藥物在5N濃度下回流24小時(shí)(苛刻條件)還未發(fā)生降解，則該藥物為“極度穩(wěn)定”一類。另一方面，若藥物在初始條件下即完全降解，那么，則應(yīng)降低酸/堿濃度，同時(shí)降低反應(yīng)溫度；若濃度降低至0.01N、反應(yīng)時(shí)間降低至2h、反應(yīng)溫度降低至25度(接近室溫)，藥物仍能充分降解，則該藥物為“極不穩(wěn)定”一類，需探索更溫和的反應(yīng)溫度和反應(yīng)pH值。

 

從上圖的酸/堿降解決策樹中可發(fā)現(xiàn)，推薦的起始降解條件為0.1N酸/堿，回流8小時(shí)；假如起始降解條件不滿足降解要求，則惡化降解條件。不推薦直接采用惡化條件進(jìn)行降解試驗(yàn)：1)直接采用更惡劣的降解條件，可能會(huì)改變藥物降解的路徑或反應(yīng)機(jī)制；2)濃度過(guò)高的酸或堿對(duì)HPLC柱子有損傷。

 

在進(jìn)行降解試驗(yàn)前了解一下藥物分子的結(jié)構(gòu)信息有時(shí)也是有幫助的，如，藥物小分子上有一個(gè)酯基，酯基易于水解，那么我們可能使用低濃度的堿即可完成試驗(yàn)。

 

氧破壞

 

為了研究藥物氧破壞的難易程度，我們可以先將藥物放置于3% H2O2在室溫下反應(yīng)6小時(shí)作為起始條件，見下圖決策樹：

如果能夠獲得足夠降解產(chǎn)物或者說(shuō)能達(dá)到試驗(yàn)?zāi)康?，那么就可不必再進(jìn)行深究試驗(yàn)；如果藥物沒有發(fā)生降解，則可以先增加反應(yīng)時(shí)間，由原來(lái)的6小時(shí)提高至24小時(shí)；如果藥物仍未發(fā)生降解，則可以增加氧化劑濃度，由3%提高到10%；若還未降解，則氧化劑濃度可提高至30%；若藥物在30%H2O2濃度下反應(yīng)24小時(shí)仍不能發(fā)生降解，則該藥物為“極度穩(wěn)定”一類。另一方面，若藥物在初始條件下即完全降解，那么，則應(yīng)降低H2O2的濃度，從3%降低至1%，同時(shí)縮短反應(yīng)時(shí)間；若氧化劑濃度降低至1%、反應(yīng)時(shí)間降低至30min，藥物仍能完全降解，則需探索更低氧化劑濃度和更短的反應(yīng)時(shí)間。

 

金屬離子有助于氧化反應(yīng)的進(jìn)行，是氧化反應(yīng)的催化劑，因此，有時(shí)額外補(bǔ)加一點(diǎn)金屬離子，氧降解反應(yīng)會(huì)增加幾千倍，如銅有助于將維生素C的氧降解提高1萬(wàn)倍。但并非所有的氧降解加金屬離子均可以，有時(shí)加入金屬離子會(huì)使原有的降解路線發(fā)生改變。

 

光降解

 

光降解與其它條件有所不同，藥物的起始反應(yīng)條件與ICH推薦的一致，即1.2*106 lux h，若在此條件下未發(fā)生降解，則可將總照度提高至5倍，即6.0*106 lux h；若此條件下藥物仍未發(fā)生降解，則該藥物為“對(duì)光不敏感”一類。

對(duì)于光降解試驗(yàn)，建議主要還是遵從ICH Q1B指南，可采用任何輸出相似于D65/ID65發(fā)射標(biāo)準(zhǔn)的光源，如具有可見-紫外輸出的人造日光熒光燈、氙燈或金屬鹵化物燈，因此，可嘗試符合ICH要求的不同燈源。若采用氙燈，達(dá)到目標(biāo)總照度(1.2*106Lux hr)一般需要4小時(shí)左右，如果采用熒光燈或近UV燈，按輸出5000-10000lux算需要5-10天才能達(dá)到目標(biāo)總照度。有時(shí)，我們可以直接將樣品置于太陽(yáng)光照下進(jìn)行降解試驗(yàn)。在炎熱的夏天，樣品置于太陽(yáng)下光照4小時(shí)產(chǎn)生的降解程度與樣品置于氙燈或金屬鹵化物燈下光照8天降解程度差不多。但需要注意的是，一年中太陽(yáng)光的照度隨季節(jié)在變。

 

需要注意的是，不管光降解反應(yīng)的現(xiàn)象如何，仿制藥的說(shuō)明書均應(yīng)與RLD的一致。

 

降解試驗(yàn)注意事項(xiàng)

 

樣品濃度與降解程度

 

根據(jù)不同文獻(xiàn)報(bào)道，加上實(shí)際經(jīng)驗(yàn)，進(jìn)行強(qiáng)制降解時(shí)推薦的起始樣品研究濃度為1 mg/ml(后期可根據(jù)實(shí)際情況而決定是否需要調(diào)整)，如果樣品溶解性差而達(dá)不到這個(gè)濃度的，可在樣品中加入甲醇。樣品濃度若太小，則有可能部分降解產(chǎn)物因濃度太低而不能被檢測(cè)到。而對(duì)于溶液劑，推薦采用最終的處方濃度同時(shí)進(jìn)行試驗(yàn)，因?yàn)橛行┧幬锶绨被嗝顾?，在一定濃度下?huì)發(fā)生聚集現(xiàn)象，低濃度下藥物很少發(fā)生聚集。

 

對(duì)于小分子藥物而言，強(qiáng)制降解一般以主成分降解5% - 20%為宜；而對(duì)于要求含量為標(biāo)示量的90% - 110%的小分子而言，建議最大主成分降解為10%。過(guò)度的降解容易造成二次降解產(chǎn)物，而這些二級(jí)產(chǎn)物又可能不會(huì)出現(xiàn)在藥物貨架期穩(wěn)定性研究期間內(nèi)產(chǎn)生，即不符合降解試驗(yàn)的最終目的。

 

樣品處理方式

 

樣品經(jīng)過(guò)酸、堿、氧化劑降解后，一般含有較高濃度的殘留反應(yīng)劑，直接進(jìn)樣會(huì)有損液相及色譜柱。對(duì)于樣品的處理，可采用稀釋法或中和法，其中稀釋法更為推薦。對(duì)于稀釋法，即將樣品中殘留的反應(yīng)劑通過(guò)稀釋至能夠耐受的范圍內(nèi)：如果采用HPLC法，稀釋劑可使用流動(dòng)相；如果采用TLC法，稀釋劑可采用甲醇、乙醇等。對(duì)于酸堿中和法，即在樣品中加入酸或堿，使樣品溶液的pH將至耐受范圍內(nèi)。稀釋法操作更簡(jiǎn)單，而中合法難以把控終點(diǎn)。

 

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)建議

 

對(duì)于強(qiáng)制降解試驗(yàn)，我們最好是能準(zhǔn)備四種樣品進(jìn)行對(duì)比試驗(yàn)：1)放置于常規(guī)條件下的空白溶液；2)放置于降解條件下的空白溶液；3)放置于常規(guī)條件下的樣品溶液；4)放置于降解條件下的樣品溶液。最終通過(guò)對(duì)這四種溶液的綜合判斷評(píng)估真實(shí)的降解產(chǎn)物。

 

在進(jìn)行降解試驗(yàn)過(guò)程中，間隔取樣有時(shí)是有必要的，有利于闡明降解過(guò)程、從而識(shí)別降解產(chǎn)物到底是一級(jí)降解產(chǎn)物還是二級(jí)降解產(chǎn)物。

 

在使用藥典和USP <621>中概述的限制使用的方法，降解試驗(yàn)是沒有必要研究的。同一個(gè)藥物的不同晶型可能具有不同的穩(wěn)定性特征，當(dāng)一個(gè)仿制藥產(chǎn)品晶型不同于RLD產(chǎn)品晶型時(shí)，原料藥應(yīng)進(jìn)行降解試驗(yàn)來(lái)評(píng)價(jià)多晶型藥物的理化變化。

 

參考資料：

1. Guidance on Conduct of Stress Tests to Determine Inherent Stability of Drugs

2. FDA Perspectives: Scientific Considerations of Forced Degradation Studies in ANDA Submissions

3. ICH Q1A (R2)、Q1B

4. 化學(xué)藥物(原料藥和制劑)穩(wěn)定性研究技術(shù)指導(dǎo)原則(修訂)