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近期，國內(nèi)學(xué)者關(guān)于電子血管的研究發(fā)表在Cell的子刊Matter雜志。近些年，柔性電子領(lǐng)域的快速發(fā)展，使傳感器和人體組織（如皮膚，血管）成為可能，柔性電子設(shè)備可以用于疾病的診斷，生理指標(biāo)的監(jiān)測和進行功能性治療。人工電子血管是如何制備出來的，可以實現(xiàn)哪些功能？讓我們一起走進這篇文章，一探究竟。

 

整合生物電子學(xué)和生物組織學(xué)的優(yōu)勢將會發(fā)揮出強大的功能來克服目前遇到的生物醫(yī)學(xué)難題。在本文中，我們介紹一種電子血管，該血管將導(dǎo)電的液態(tài)金屬聚合物環(huán)與構(gòu)成血管的三層細胞整合在一起去模擬天然的血管。該電子血管表現(xiàn)出良好的生物相容性和機械性能，可進行電刺激和電穿孔，并在兔模型體內(nèi)實驗中表現(xiàn)出極佳的血流的通暢性。

 

文章研究亮點

 

利用生物可降解的聚合物和金屬聚合物導(dǎo)體合成電子血管。

 

體外實驗顯示電刺激可促進臍靜脈血管內(nèi)皮細胞的增殖和遷移。

 

電穿孔技術(shù)可以將靶基因傳遞到血管的不同細胞層中。

 

電子血管系統(tǒng)有較好的生物相容性，并在兔模型中得到很好的驗證

 

摘要

 

生物電子學(xué)的進展具有巨大的潛能去解決心血管系統(tǒng)中尚未克服的生物醫(yī)學(xué)難題。利用聚合物（L-lactide-co-e-caprolactone）來封裝液態(tài)金屬，可以制備出具備良好彈性且可降解的電路環(huán)，我們開發(fā)了一種電子血管，該血管可以將具備生物彈性的電路環(huán)與三層血管細胞集成在一起，來仿生天然血管，該電子血管可通過電刺激改善促進血管內(nèi)皮化過程，通過電穿孔技術(shù)將靶基因可控的遞送到血管的特定部位發(fā)揮生物學(xué)功能。電子血管在血管系統(tǒng)中具有出色的生物相容性，在兔子模型植入后在3月內(nèi)仍可顯示出良好的通暢性。在不久的將來，通過血管組織-機器接口，電子血管將會是心血管系統(tǒng)中進行診斷和治療的理想平臺，實現(xiàn)個體化醫(yī)療。

 

進步與潛力

 

現(xiàn)有的小直徑（<6 mm）組織工程血管（TEBV）植入后主要依賴宿主的重建過程發(fā)揮功能，植入后并不能針對各種病理環(huán)境提供進一步的診斷或治療作用。在本研究中，我們制備出了一種具有良好生物相容性，柔韌性，機械強度且可降解的電子血管，該血管可以實現(xiàn)原位電刺激（促進內(nèi)皮化過程）和電穿孔（在血管細胞的特定層中傳遞基因），在兔模型中表現(xiàn)出良好的通暢性。它具有傳統(tǒng)可生物降解TEBV的電功能，并為我們提供了一個新的平臺來解決目前小直徑血管遇到的一些問題。當(dāng)與人工智能等新興技術(shù)結(jié)合使用時，它可以發(fā)揮血管組織-機器界面的橋梁作用，對健康數(shù)據(jù)收集/存儲和早期干預(yù)，來促進未來的個體化醫(yī)療。

 

背景介紹

 

心血管疾病仍然是全世界死亡的第一大原因，在冠狀動脈旁路移植術(shù)治療心血管疾病中，目前還沒有小直徑（<6 mm）組織工程血管（TEBV）能夠滿足臨床需求。無數(shù)科研工作者一直致力于制備符合臨床需求的組織工程血管，近年來已經(jīng)利用如脫細胞基質(zhì)，自組裝細胞片以及生物活性和仿生材料等多種方法制備組織工程血管。然而令人遺憾的是目前大多數(shù)這些方法制備的組織工程血管僅可作為支架發(fā)揮機械支持的作用，并且主要依賴于宿主組織細胞進行重塑，在幫助新血管再生方面存在明顯的局限性。迄今為止，它們均未取得令人滿意的臨床結(jié)果。尤其是血流與組織工程血管之間復(fù)雜的相互作用通常會導(dǎo)致炎癥發(fā)生，進而產(chǎn)生血栓，內(nèi)膜增生或支架附近平滑肌細胞積聚等問題。為了解決這些問題，新一代組織工程血管不僅充當(dāng)血管支架以提供機械支持，促進宿主細胞募集，而且還應(yīng)具有主動響應(yīng)并與天然重塑過程相結(jié)合的能力，以便在植入后提供適應(yīng)性治療。

 

將活體組織與柔性電子設(shè)備相結(jié)合，可以使常規(guī)TEBV具有更多的功能和能力，以克服現(xiàn)有的生物醫(yī)學(xué)瓶頸，例如通過原位感測血流量和溫度以及通過治療性藥物或基因遞送進行治療。在之前的研究工作中，我們已經(jīng)開發(fā)出許多方法來在血管不同分層中封裝不同類型細胞以期模仿天然的血管結(jié)構(gòu)，主要有如應(yīng)力誘導(dǎo)的自卷膜和逐層技術(shù)。最近，我們開發(fā)了可印刷的金屬聚合物導(dǎo)體（MPC），它具有出色的相容性和高拉伸性。在本研究中，我們開發(fā)了一種電子血管，該血管通過將液態(tài)金屬與聚合物（L-lactide-co-e-caprolactone）（PLC）結(jié)合到金屬聚合物導(dǎo)體（MPC）中，將柔性電極集成到可生物降解的支架中。為證實這一概念的可行性，我們使用電子血管進行體外電刺激和電穿孔：通過電刺激，電子血管可以有效地促進傷口愈合模型中的細胞增殖和遷移。它還可以通過電穿孔將綠色熒光蛋白（GFP）DNA質(zhì)粒原位遞送到三種血管細胞中。通過使用兔頸動脈置換模型的3個月體內(nèi)研究，我們評估了電子血管在血管系統(tǒng)中的功效和生物安全性，并通過超聲成像和動脈造影證實了其通暢性。總之，我們的研究結(jié)果為將彈性，可降解生物電子學(xué)整合到血管系統(tǒng)中鋪平了道路，該系統(tǒng)可以用作如基因療法，電刺激和電子控制的藥物釋放等治療的平臺。

主要結(jié)果解讀

 

1、電子血管的制備流程：

 

 

（1）液態(tài)金屬顆粒（LMP）制備：利用Ga-In合金制備金屬顆粒核的部分，外部包裹Ga-In氧化物作為殼，設(shè)計出直徑約為2毫米大小具備核-殼結(jié)構(gòu)的液態(tài)金屬顆粒（LMP）。

 

（2）液態(tài)金屬導(dǎo)電油墨制備：利用超聲處理鎵銦合金（EGAIn）和揮發(fā)性溶劑（1-癸醇）的混合物來制備液態(tài)金屬導(dǎo)電油墨。

 

（3）導(dǎo)電油墨噴涂制模：我們在聚對苯二甲酸乙二醇酯（PET）膜的網(wǎng)格模板上噴涂一層導(dǎo)電油墨，通過對電極的調(diào)整達到最優(yōu)的電穿孔和電刺激效果，通過調(diào)整電極設(shè)計，我們既可以將電極分布在特定區(qū)域中，可針對單個血管層（內(nèi)膜/中膜/外膜），也可以對整個三層電極進行全電極分布。

 

（4）剝離MPC-PLC膜：基于LMP的電路嵌入到PLC解決方案中（在CH2Cl2中為5 wt％），在化學(xué)罩中蒸發(fā)掉多余的揮發(fā)性溶劑（1-癸醇）后將MPC-PLC膜從PET基材上剝離下來（MPC-PLC膜的厚度約為50毫米，可通過更改PLC體積進行調(diào)整厚度）。

 

（5）卷曲MPC-PLC膜制備電子血管：我們通過在聚四氟乙烯卷軸的幫助下卷起MPC-PLC膜來制備電子血管，結(jié)果顯示MPC電路環(huán)可以很好地分布在三維（3D）多層管狀結(jié)構(gòu)中。制備的電子血管的內(nèi)徑約為2毫米，最小直徑約為0.5毫米，制備電子血管的MPC-PLC膜富有彈性且可降解，其中的MPC電路環(huán)顯示出良好的導(dǎo)電功能，其傳導(dǎo)率可達8 × 103 S cm，電路的DR / R在經(jīng)過大約1000次彎曲和摩擦后任然可保持恒定。設(shè)計初預(yù)計PLC在1-2年內(nèi)降解，在體外實驗顯示：MPC-PLC膜置于PBS（37°C）中孵育8周，其質(zhì)量損失約為10％。

 

（6）確定導(dǎo)電電路：LMP（液態(tài)金屬顆粒）在剝離過程中可能會破裂，并釋放Ga-In合金以使電路導(dǎo)電。為確定確定了制備的電子血管的導(dǎo)電電路的結(jié)構(gòu)，我們通過添加過量的鹽酸來腐蝕Ga-In合金，結(jié)果顯示LMP（液態(tài)金屬顆粒）均勻分布在蜂窩PLC主機中，并形成相干的導(dǎo)電路徑。

 

2、體外實驗檢測電子血管效果：

 

 

為了評估電子血管的生物相容性，我們使用微流體技術(shù)以模仿天然血管的方式實現(xiàn)了三種細胞在血管中的精確三維結(jié)構(gòu)。通過使用多通道微流控芯片，我們在MPC-PLC膜上依次遞送人臍靜脈內(nèi)皮細胞（HUVEC，藍色），人主動脈平滑肌細胞（SMC，綠色）和人主動脈成纖維細胞（HAF，紅色）。我們根據(jù)MPC-PLC膜的厚度和管子的直徑設(shè)計出每個通道的寬度，以匹配管子各層的周長。為了區(qū)分不同的細胞類型，我們將HUVEC，SMC和HAF用不同的熒光染料（HUVEC，CellTracker紫色；SMC，CellTracker綠色；HAF，CellTracker深紅色）染色，然后將其植入微流控芯片。在培養(yǎng)基（DMEM高糖，10％胎牛血清FBS，37 ℃，5％CO2）中孵育1天后，將細胞附著到MPC-PLC膜上。我們將微流控芯片從充滿細胞的MPC-PLC膜上剝離，并用PTFE軸卷起，形成3D多層管狀結(jié)構(gòu)，其中HUVEC，SMC和HAF均勻分布在內(nèi)層，中間層， 外層，很好地模仿了天然血管的結(jié)構(gòu)。為了更好地了解分布在電子血管不同層中的血管細胞，我們用活體細胞示蹤劑CellTracker DiO，CellTracker DiI，CellTracker DiD為了更好地了解分布在電子血管不同層中的血管細胞，我們用CellTracker DiO，CellTracker DiI，CellTracker DiD和CellTracker blue對HUVEC，SMC，HAF和MPC-PLC層進行了染色，以顯示不同層的相對分布。我們使用了生物醫(yī)學(xué)纖維蛋白膠來促進不同層的結(jié)合，我們孵育培養(yǎng)了充滿細胞的電子血管14天，并用鈣黃綠素對電子血管細胞進行了染色。結(jié)果回示：MPC-PLC膜上均勻分布的綠色熒光，提升培養(yǎng)14天后電子血管內(nèi)細胞仍保持較高的活力。我們測量了離子通過MPC-PLC膜的傳輸效率來評估和量化電子血管的滲透性，結(jié)果顯示：Ca2+，F(xiàn)e3+和Mg2+可很好的滲透到電子血管中。我們還進行了溶血試驗，結(jié)果表明電子血管具有很好的血液生物相容性?？傊?，體外實驗表明電子血管表現(xiàn)出優(yōu)異的生物相容性，我們將設(shè)計進一步實驗對嵌入式MPC電路進行了進一步的功能測試，即電刺激和電穿孔。

3、體外電刺激促進HUVEC增殖和遷移：

 

為了證明電子血管的功能，我們進行了體外電刺激以改善HUVEC的增殖和遷移。直流（DC）電場已被證明可以有效提高體外和體內(nèi)的血管生成。我們通過使用多室聚二甲基硅氧烷（PDMS）芯片在MPC-PLC膜上對HUVEC進行了圖案化。每個腔室中的初始細胞數(shù)相同即3×104個。孵育12小時后，我們施加了不同的直流電壓以產(chǎn)生不同的電場強度，分別為：25、50、75、100、200、400 mVmm-1 。經(jīng)過2天的孵育和電刺激后，我們在每個樣品上隨機選擇了六個不同的區(qū)域，并通過激光掃描共聚焦顯微鏡對其進行了分析。我們用Hoechst 33342染色細胞核（藍色），并分別用鈣黃綠素AM（綠色）和碘化丙錠（PI）（紅色）對活細胞和死細胞染色。綠色細胞占據(jù)了整個區(qū)域，表明電刺激并未損害HUVEC的增殖。我們使用ImageJ系統(tǒng)數(shù)細胞核。50 mVmm-1以下的細胞數(shù)最高，約為對照的2.4倍。隨后的CCK-8檢測增值實驗得出相同的結(jié)果。綜上，我們推測直流電場已經(jīng)選擇性地調(diào)節(jié)了某些生長因子來影響血管生成。我們探索了在不同直流電場強度下HUVEC的遷移。我們使用10ul吸頭在PDMS上劃了一個劃痕。施加50 mVmm-1 的電場后，HUVEC遷移了750 mm，傷口在24 h后完全愈合, 因此，體外直流電刺激有效地促進了HVEC的增殖和遷移。

 

我們進一步評估了電刺激在3D血管中內(nèi)皮化的有效性。在MPC-PLC膜上對HUVEC進行了構(gòu)圖，并使用10 uL吸頭在充滿細胞的膜上進行了刮擦。我們將2D充滿細胞的膜轉(zhuǎn)變?yōu)?D充滿細胞的結(jié)構(gòu)，并將其連接到電化學(xué)工作站以測試增殖和遷移。在多個樣品上施加了50 mVmm-1 的電場，并觀察了在不同時間點的增殖和遷移。用鈣黃綠素AM（綠色）和PI（紅色）對活細胞和死細胞進行了染色。同時對細胞進行計數(shù)，細胞密度高于對照組。24小時后，HUVEC形成了完整的內(nèi)皮層。為了更好地評估電刺激下MPC電路的生物相容性，我們將電刺激時間延長至10天，活/死染色表明電子血管有良好的生物相容性。

4、體外電穿孔實驗：

 

為了進一步證明電子血管的功能，我們設(shè)計了電穿孔的電路模式，能夠靶向不同層血管細胞中的病灶部位。我們使用可針靶向血管三層細胞的電路環(huán)進行電穿孔實驗。我們將細胞接種到MPC-PLC膜上，并將其轉(zhuǎn)化為3D管狀結(jié)構(gòu)用于電穿孔。在電穿孔之前，我們將3D細胞負載的電子血管浸入GFP質(zhì)粒DNA溶液中10分鐘。GFP質(zhì)粒DNA也可以凍干到MPC-PLC膜上，然后播種細胞并轉(zhuǎn)化為3D結(jié)構(gòu)進行電穿孔。我們將載有3D細胞的電子血管連接到電穿孔器上以產(chǎn)生DC脈沖，并實現(xiàn)了GFP和DNA質(zhì)粒在三種血管細胞中的遞送。為了優(yōu)化電子血管的性能，我們發(fā)現(xiàn)了決定電穿孔效力的兩個主要參數(shù)，包括電壓和脈沖持續(xù)時間。我們用不同的電壓和脈沖持續(xù)時間進行了電穿孔實驗。結(jié)果回示：如果電壓太低，將導(dǎo)致轉(zhuǎn)染功效低下，甚至不進行轉(zhuǎn)染。如果電壓太高或脈沖持續(xù)時間太長，也將導(dǎo)致功效低下且發(fā)生細胞死亡。最終摸索出最佳電穿孔條件為：電壓60 V，脈沖持續(xù)時間為100 ms，五個脈沖的脈沖間隔為1 s，可將GFP質(zhì)粒DNA遞送到三種血管細胞中，并且實現(xiàn)了GFP DNA的表達，結(jié)果顯示GFP在三層血管細胞之間成功表達，并且它們在電子血管中表現(xiàn)出均勻的3D分布，超過95％的細胞表達綠色熒光。

 

為了評估電子血管在體內(nèi)進行電穿孔的潛力，我們將MPC-PLC膜上的GFP質(zhì)粒DNA凍干，以測試其有效性。通過將載有質(zhì)粒的MPC-PLC膜附著到離體的兔血管組織上進行電穿孔，該膜的電壓為60 V，脈沖持續(xù)時間為100 ms，脈沖間隔為1 s，持續(xù)五個脈沖。培養(yǎng)2天后，分離出的兔血管組織。結(jié)果顯示出良好的轉(zhuǎn)染效果。

5、電子血管的機械性能測試：

 

為了確定電子血管是否適合體內(nèi)植入，我們在植入前測量了電子血管的機械性能，包括應(yīng)力-應(yīng)變曲線，順應(yīng)性和破裂壓力。結(jié)果顯示：電子血管的彈性模量約為130MPa，電子血管的極限抗拉強度約為27MPa，均比天然頸動脈的值高。電子血管的初始順應(yīng)性在100-80 mm Hg范圍內(nèi)為每100 mm Hg約5％，顯著低于天然頸動脈。電子血管的破裂壓力約為2,800 mm Hg；與天然頸動脈的值相同。電子血管的斷裂伸長率約為650％，為天然頸動脈值的兩倍。綜上表面電子血管具備良好的機械力學(xué)性能，具備植入體內(nèi)的條件。

6、電子血管在兔體內(nèi)植入和原位監(jiān)測實驗：

 

為了研究將電子血管作為血管植入物的可行性，本研究選擇了新西蘭兔（年齡為200–300天；體重為3-4 kg）作為動物模型，為避免宿主抗移植物的免疫排斥反應(yīng)，體內(nèi)移植實驗使用脫細胞電子血管植替代了其頸總動脈。通過多普勒超聲成像和動脈造影監(jiān)測了植入的電子血管在體情況，多普勒超聲成像顯示：電子植入后3個月后，任具有良好的血流，血管的直徑保持在一個相對恒定的值（約2.3毫米），平均血流速度處于正常值范圍內(nèi)，約為0.47ms-1；動脈造影常常作為血管通暢性的檢測的金標(biāo)準(zhǔn)，電子血管因有液態(tài)金屬電路，使得在造影下有良好的對比度，便于觀察，造影結(jié)果顯示：電子血管與天然頸動脈吻合良好，血流通暢，電子血管直徑?jīng)]有縮小，未發(fā)生狹窄。

7、電子血管在體研究：

 

我們解剖分析植入體內(nèi)3個月后的電子血管，結(jié)果顯示：植入的電子血管的內(nèi)腔和外表面光滑，被重塑組織覆蓋，由于沒有血壓的緣故，解剖出的天然血管的直徑顯著減小，而電子血管可保持與植入前相同的直徑。后將解剖出的電子血管行掃描電鏡檢測，觀察其電路的微結(jié)構(gòu)。結(jié)果回示：MPC-PLC膜仍與MPC電路和PLC主體保持叉指式結(jié)構(gòu)，膜上形成了一層新組織，覆蓋了MPC-PLC膜內(nèi)表面，有與天然血管壁上的數(shù)量相似的紅細胞覆蓋；植入后3個月檢測電子血管中電路的導(dǎo)電性，結(jié)果顯示：MPC電路仍處于導(dǎo)電狀態(tài)，電導(dǎo)率約為7.2×3103 S cm-1。

 

為觀察植入的電子血管的組織學(xué)形態(tài)變化，對電子血管進行了組織學(xué)染色，設(shè)置天然頸動脈血管為對照，結(jié)果顯示：HE染色顯示，電子血管橫截面為圓形、連續(xù)呈紅色，與天然血管相似。三層MPC-PLC膜合并形成一個完整的層，可見不同層之間分泌出大量的細胞外基質(zhì)。將電子血管中的細胞密度與天然頸動脈進行了比較，結(jié)果顯示：電子血管的細胞密度約為400 cells mm2，天然頸動脈約為535 cells mm2。電子血管的內(nèi)腔中形成了具有彎曲結(jié)構(gòu)的致密細胞層，提示植入的電子血管得到了很好的內(nèi)皮化，從而確保了良好的血流通過。為進一步分析植入的電子血管中的成分，將其進行Masson染色（Masson染色可以很好區(qū)分和評估肌原纖維和膠原蛋白）和Verhoeff染色（Verhoeff染色可以明確彈性蛋白纖維的存在）。Masson染色和Verhoeff染色均提示電子血管各層內(nèi)部以及不同層之間均分布均勻的膠原蛋白和彈性纖維，與天然血管相比，電子血管細胞外基質(zhì)分泌更多，這可能與材料降解和組織重塑有關(guān)。綜上結(jié)果表明，電子血管植入3個月后，仍可穩(wěn)定的工作發(fā)揮作用。

參考文獻：

Cheng et al., Electronic Blood Vessel, Matter (2020), https://doi.org/10.1016/j.matt.2020.08.029