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柱層析技術(shù)也稱柱色譜技術(shù)。一根柱子里先填充不溶性基質(zhì)形成固定相，將混合樣品加到柱子上后用特別的溶劑洗脫，溶劑組成流動(dòng)相。在樣品從柱子上洗脫下來的過程中，根據(jù)混合物中各組分在固定向和流動(dòng)相中的分配系數(shù)不同經(jīng)過多次反復(fù)分配，將不同組分逐一分離。  硅膠層析法的分離原理是根據(jù)物質(zhì)在硅膠上的吸附力不同而得到分離，一般情況下極性較大的物質(zhì)易被硅膠吸附，極性較弱的物質(zhì)不易被硅膠吸附，整個(gè)層析過程即是吸附、解吸、再吸附、再解吸過程。根據(jù)填充基質(zhì)和樣品分配交換原理不同，離子交換層析，凝膠過濾層析和親和層析是三種分離混合物的經(jīng)典層析技術(shù)。

 

柱層析分離凈化的實(shí)驗(yàn)技巧和方法

 

1　柱層析操作方法的選擇

　　目前 ,柱色譜分離的操作方式 ,主要包括常壓分離、減壓分離和加壓分離 3種模式。常壓分離是最簡單的分離模式方便、簡單 ,但是洗脫時(shí)間長。減壓分離盡管能節(jié)省填料的使用量 ,但是由于大量的空氣通過填料會(huì)使溶劑揮發(fā) ,并且有時(shí)在柱子外面會(huì)有水汽凝結(jié) ,以及有些易分解的化合物也難以得到 ,而且還必須同時(shí)使用水泵或真空泵抽氣。加壓分離可以加快淋洗劑的流動(dòng)速度 ,縮短樣品的洗脫時(shí)間 ,是一種比較好的方法 ,與常壓柱類似 ,只不過外加壓力使淋洗液更快洗脫。壓力的提供可以是壓縮空氣 ,雙連球或者小氣泵等。

2　柱子規(guī)格的選擇

　　市場(chǎng)上有各種規(guī)格的柱層析分離柱。柱子長了 ,相應(yīng)的塔板數(shù)就高 ,分離就好。目前市場(chǎng)上的柱子 ,其徑高比一般在1: 5～10范圍 ,在實(shí)際使用時(shí) ,填料量一般是樣品量的 30～40倍 ,具體的選擇要根據(jù)樣品的性質(zhì)和含量進(jìn)行具體分析。如果所需組分和雜質(zhì)的分離度較大 ,就可以減少填料量 ,使用內(nèi)徑相對(duì)較小的柱子 (如 2 cm × 20 cm的柱子 ) ;如果 Rf相差不到 0.1,就要加大柱子 ,增加填料量 ,比如用 3 cm內(nèi)徑的柱子。

3　裝柱

　　柱層析色譜柱的填裝主要有濕法和干法兩種 ,濕法省事 ,一般用淋洗劑溶解樣品 ,也可以用二氯甲烷、乙酸乙酯等 ,但溶劑越少越好 ,不然溶劑就成了淋洗劑了。柱子底端的活塞一定不要涂潤滑劑 ,否則會(huì)被淋洗劑帶到淋洗液中 ,可以采用聚四氟乙烯材料的閥門。干法和濕法裝柱沒什么實(shí)質(zhì)性差別,只要能把柱子裝實(shí)就行。裝完的柱子應(yīng)該有適度的緊密(太密了淋洗劑流速太慢 ) ,并且一定要均勻 ,不然樣品就會(huì)從一側(cè)斜著流動(dòng)。同時(shí)柱中不能有大氣泡 ,大多數(shù)情況下有些小氣泡沒太大的影響 ,因?yàn)橹灰訅簹馀菥涂上?。但是柱子更忌諱的是開裂 ,開裂會(huì)影響分離效果 ,甚至報(bào)廢。

4　溶劑的選擇

      極性小的用乙酸乙酯：石油醚系統(tǒng)；極性較大的用甲醇：氯仿系統(tǒng)；極性大的用甲醇：水：正丁醇：醋酸系統(tǒng)；拖尾可以加入少量氨水或冰醋酸。

　　選擇一個(gè)合適的溶劑系統(tǒng)是柱層析分離的關(guān)鍵。在選用柱層析洗脫劑時(shí)首先要考慮三個(gè)方面的因素:溶解性 ( Solubil2ity)、親合性 (Affinity)和分離度 (Res oluti on)。溶劑應(yīng)選擇價(jià)廉、安全、環(huán)保的 ,可以考慮石油醚、乙酸乙酯、二氯甲烷、乙醚、甲醇和正己烷等等。但正己烷價(jià)格較高 ,乙醚很易揮發(fā) ,二氯甲烷和甲醇與硅膠的吸附是一個(gè)放熱過程 ,易使柱子產(chǎn)生氣泡。其他的溶劑用的相對(duì)較少 ,要依不同需要選擇。另外值得一提的是 ,由于我們進(jìn)行的是痕量分析 ,淋洗劑的純度必須關(guān)注 ,一般使用農(nóng)藥殘留級(jí)或 HPLC級(jí)的 ,如果是分析純的必須進(jìn)行精制。同時(shí)溶劑在過柱后最好回收使用 ,一方面環(huán)保 ,另一方面也能節(jié)省部分經(jīng)費(fèi)。

5　上樣

　　用少量的溶劑溶解樣品加樣 ,加完后將底端的活塞打開 ,待溶劑層下降至石英砂面時(shí) ,再加少量的低極性溶劑 ,然后再打開活塞 ,如此兩三次 ,一般石英砂就基本是白色的了。加入淋洗劑 ,一開始不要加壓 ,等溶解樣品的溶劑和樣品層有一段距離 (2～4 cm) ,再加壓 ,這樣避免了溶劑 (如二氯甲烷等 )夾帶樣品快速下行。很多樣品在上柱前粘性較大 ,上樣后在柱上又會(huì)析出 ,這一般都是比較大量的樣品才會(huì)出現(xiàn) ,是因?yàn)樘盍蠈?duì)樣品的吸附飽和所致。有些樣品溶解性差,能溶解的溶劑 (比如 DMF,DMSO等)又不能上柱 ,這樣就必須用干法上柱了。

6　淋洗液的收集和濃縮

　　用硅膠作固定相過柱子的原理是一個(gè)吸附與解吸的平衡。如果樣品與硅膠的吸附比較強(qiáng)的話 ,就不容易流出 ,這時(shí)可以采用氧化鋁作固定相。柱層析后的淋洗液 ,由于使用了較多的溶劑 ,必須進(jìn)行濃縮 ,如果待測(cè)物具有一定的揮發(fā)性 ,最好使用常壓揮發(fā)溶劑 ,否則易導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果偏低。

 

7  其他整理自網(wǎng)絡(luò)的經(jīng)驗(yàn)

裝柱子（添硅膠）時(shí)，有兩種方法：即濕法裝柱和干法裝柱，二者各有優(yōu)劣。不論干法還是濕法，硅膠（固定相）的上表面一定要平整，并且硅膠（固定相）的高度一般為15cm左右，太短了可能分離效果不好，太長了也會(huì)由于擴(kuò)散或拖尾導(dǎo)致分離效果不好。 

濕法裝柱是先把硅膠用適當(dāng)?shù)娜軇┌鑴蚝?，再填入柱子中，然后再加壓用淋洗?quot;走柱子"，本法最大的優(yōu)點(diǎn)是一般柱子裝的比較結(jié)實(shí)，沒有氣泡。 
干法裝柱則是直接往柱子里填入硅膠，然后再輕輕敲打柱子兩側(cè)，至硅膠界面不再下降為止，然后再填入硅膠至合適高度，最后再用油泵直接抽，這樣就會(huì)使得柱子裝的很結(jié)實(shí)。接著是用淋洗劑"走柱子"，一般淋洗劑是采用TLC分析得到的展開劑的比例再稀釋一倍后的溶劑。通常上面加壓，下面再用油泵抽，這樣可以加快速度。干法裝柱較方便，但最大的缺陷在于"走柱子"時(shí)，由于溶劑和硅膠之間的吸附放熱（可以用手摸柱子明顯感覺到），容易產(chǎn)生氣泡，這一點(diǎn)在使用低沸點(diǎn)的淋洗劑時(shí)如乙醚，二氯甲烷更為明顯。雖然產(chǎn)生的氣泡在加壓的情況下不易察覺，但是，一旦撤去壓力，如在上樣、加溶劑等操作的時(shí)候，氣泡就會(huì)釋放出來，嚴(yán)重時(shí)，整個(gè)柱子變花，樣品不可能平整地通過，當(dāng)然也就談不上分離了。解決的辦法是：第一、硅膠一定要天結(jié)實(shí)；第二、一定要用較多的溶劑"走柱子"，一定要到柱子的下端不再發(fā)燙，恢復(fù)到室溫后再撤去壓力。 也有介紹在硅膠的最上層填上一小層石英砂，防止添加溶劑的時(shí)候，使得樣品層不再整齊。但我的感覺是如果小心上樣，添加溶劑，則沒有這個(gè)必要。

上樣也有干法和濕法之分：干法就是把待分離的樣品用少量溶劑溶解后，在加入少量硅膠，拌勻后再旋去溶劑。如此得到的粉末再小心加到柱子的頂層。干法上樣較麻煩，但可以保證樣品層很平整。濕法上樣就是用少量溶劑（最好就是展開劑，如果展開劑的溶解度不好，則可以用一極性較大的溶劑，但必須少量）將樣品溶解后，再用膠頭滴管轉(zhuǎn)移得到的溶液，沿著層析柱內(nèi)壁均勻加入。然后用少量薌洗滌后，再加入。

濕法較方便，柱層析和TLC是有機(jī)化學(xué)工作者必須下苦功夫的兩項(xiàng)實(shí)驗(yàn)技術(shù)。這兩項(xiàng)技術(shù)掌握與否，對(duì)于提高實(shí)驗(yàn)的效率至關(guān)重要。常見的例子是：在柱層析時(shí)，由于層析柱中的硅膠填料裝得不均勻（沒有填嚴(yán)實(shí)），使得柱子在淋洗過程中就因?yàn)槌霈F(xiàn)太多氣泡變花，導(dǎo)致分離效果不好。更常見的例子是：層析柱雖然裝得不錯(cuò)，但是由于淋洗劑選擇不恰當(dāng)，結(jié)果導(dǎo)致幾十毫克產(chǎn)品，用了幾百毫升淋洗劑都還沒有完全分離。分離同樣的東西，熟手可能只需要半個(gè)小時(shí)，而一個(gè)層析技術(shù)不過關(guān)的人可能半天都不能得到純品。由此可見，這兩項(xiàng)技術(shù)掌握與否，對(duì)于提高工作效率，減輕工作量，減少有機(jī)溶劑的使用，從而對(duì)身心健康和環(huán)境保護(hù)都有明顯的作用。 

柱層析關(guān)鍵在于柱子是否裝好和淋洗劑是否選擇恰當(dāng)。而淋洗劑的選擇則是通過TLC確定。這里要指出的一點(diǎn)是：TLC的作用除了跟蹤反應(yīng)進(jìn)程，檢測(cè)試劑和原料純度外，一個(gè)重要的用途就是為柱層析選擇適當(dāng)?shù)牧芟磩?br style="margin: 0px; padding: 0px; max-width: 100%; box-sizing: border-box !important; overflow-wrap: break-word !important;" /> 上樣完畢后，接著即用淋洗劑淋洗。淋洗劑一般采用TLC分析得到的展開劑的比例再稀釋一倍后的溶劑。由于層析柱和薄板的不同，即使兩者使用的硅膠都相同，但是在把TLC分析得到的展開劑用在柱層析時(shí)，也顯得極性偏大，所以要稀釋一倍，但又不能稀釋太多，否則成了靠擴(kuò)散作用來分離，效果也不會(huì)好。

接下來談TLC，需要切記的是： 
第一、某種樣品在這種展開劑中只顯示一個(gè)點(diǎn)，并不等于在別的展開劑中也只顯示一個(gè)點(diǎn)。因此在尋找展開劑時(shí)，多嘗試幾種比例不同，成分不同的展開劑。展開劑的極性太小，點(diǎn)分不開，極性太大，也分不開.一般以目標(biāo)產(chǎn)物的Rf值在0.3左右為最佳。
第二、點(diǎn)不能點(diǎn)得太濃,否則容易重疊,不易判斷,因?yàn)槿绻麅蓚€(gè)點(diǎn)相近的話,一濃就變成一個(gè)點(diǎn)了。第三、板上點(diǎn)的展開的清晰程度和溶劑的極性和物質(zhì)在該溶劑中的溶解性有關(guān)，只有兩者比較合適才能有一個(gè)交好的分離效果。 
選擇適當(dāng)?shù)恼归_劑是首要任務(wù).一般常用溶劑按照極性從小到大的順序排列大概為：石油迷<己烷<苯<乙醚<THF<乙酸乙酯<丙酮<乙醇<甲醇使用單一溶劑，往往不能達(dá)到很好的分離效果，往往使用混合溶劑通常使用一個(gè)高極性和低級(jí)性溶劑組成的混合溶劑，高極性的溶劑還有增加區(qū)分度的作用，常用的溶劑組合有：Petroleumether/Ethyl acetate, Petroleum ether/Acetone, Petroleum ether/Ether, Petroleumether/CH2Cl2, CH2Cl2/ethyl acetate, ethyl acetate/ MeOH, CHCl3/ ethyl acetate
展開劑的比例要靠嘗試.一般根據(jù)文獻(xiàn)中報(bào)道的該類化合物用什么樣的展開劑，就首先嘗試使用該類展開劑，然后不斷嘗試比例，直到找到一個(gè)分離效果好的展開劑。很多時(shí)候,展開劑的選擇要靠自己不斷變換展開劑的組成來達(dá)到最佳效果。我在實(shí)驗(yàn)中，為了實(shí)現(xiàn)一個(gè)配體與其他雜質(zhì)有效分離，曾經(jīng)嘗試了所有的溶劑用來兩兩組合后，最后才找到petroleumether/THF這類不常見的混合溶劑。 
一般把兩種溶劑混合時(shí),采用高極性/低極性的體積比為1/3的混合溶劑,如果有分開的跡象,再調(diào)整比例,達(dá)到最佳效果，如果沒有分開的跡象，最好是換溶劑。
對(duì)于在硅膠中這種酸性物質(zhì)上易分解的物質(zhì)，在展開劑里在利用TLC跟蹤反應(yīng)時(shí)，在點(diǎn)板的時(shí)候往往是反應(yīng)體系的混和溶液點(diǎn)一個(gè)點(diǎn)A，每種難揮發(fā)的原料各點(diǎn)一個(gè)點(diǎn)B,C, D等等，然后所有的原料和反應(yīng)體系的混合溶劑再共同點(diǎn)一個(gè)混合點(diǎn)X，這些點(diǎn)在板上的位置如圖所示：A X B C D
這樣的好處是展開后可以清楚地看見每個(gè)點(diǎn)的位置，把A這個(gè)點(diǎn)展開后的各個(gè)層份的點(diǎn)與B,C,等原料比較，從而判斷原料消失沒有，點(diǎn)混合點(diǎn)X的目的在于，方便觀察，因?yàn)橛袝r(shí)候，板展開后，各點(diǎn)的位置有些變形，或者由于邊緣效應(yīng)等等，使得判斷不易。
利用TLC判斷物質(zhì)的純度時(shí)，往往要和NMR相結(jié)合，因?yàn)槟撤N樣品在這種展開劑中只顯示一個(gè)點(diǎn)，并不等于在別的展開劑中也只顯示一個(gè)點(diǎn)。但有趣的是，由于H NMR可鑒別的純度也就在95%左右，有時(shí)候H NMR現(xiàn)示較純的東西，一點(diǎn)板就會(huì)發(fā)現(xiàn)有幾個(gè)點(diǎn)。所以，兩者要結(jié)合使用。但是自己以前的樣品，則可以只通過點(diǎn)板來判斷純度。

 

硅膠柱層析慣用方法

1.稱量。200-300目硅膠，稱30-70倍于上樣量；如果極難分，也可以用100倍量的硅膠H。干硅膠的視密度在0.4左右，所以要稱40g硅膠，用燒杯量100ml也可以。
2.攪成勻漿。加入干硅膠體積一倍的溶劑用玻璃棒充分?jǐn)嚢?。如果洗脫劑是石油?乙酸乙酯/丙酮體系，就用石油醚拌；如果洗脫劑是氯仿/醇體系，就用氯仿拌。如果不能攪成勻漿，說明溶劑中含水量太大，尤其是乙酸乙酯/丙酮，如果不與水配伍走分配色譜的話，必須預(yù)先用無水硫酸鈉久置干燥。氯仿用無水氯化鈣干燥，以除去1%的醇。如果樣品對(duì)酸敏感，不能用氯仿體系過柱。
3.裝柱。將柱底用棉花塞緊，不必用海沙，加入約1/3體積石油醚（氯仿），裝上蓄液球，打開柱下活塞，將勻漿一次傾入蓄液球內(nèi)。隨著沉降，會(huì)有一些硅膠沾在蓄液球內(nèi)，用石油醚（氯仿）將其沖入柱中。
4.壓實(shí)。沉降完成后，加入更多的石油醚，用雙聯(lián)球或氣泵加壓，直至流速恒定。柱床約被壓縮至9/10體積。無論走常壓柱或加壓柱，都應(yīng)進(jìn)行這一步，可使分離度提高很多，且可以避免過柱時(shí)由于柱床萎縮產(chǎn)生開裂。
5.上樣。干法濕法都可以。海沙是沒必要的。上樣后，加入一些洗脫劑，再將一團(tuán)脫脂棉塞至接近硅膠表面。然后就可以放心地加入大量洗脫劑，而不會(huì)沖壞硅膠表面。
6.過柱和收集。柱層析實(shí)際上是在擴(kuò)散和分離之間的權(quán)衡。太低的洗脫強(qiáng)度并不好，推薦用梯度洗脫。收集的例子：10mg上樣量，1g硅膠H，0.5ml收一餾分；1-2g上樣量，50g硅膠（200-300目），20-50ml收一餾分。
7.檢測(cè)。要更多地使用專用噴顯劑，如果僅用紫外燈，會(huì)損失較多產(chǎn)品，紫外的靈敏度一般比噴顯劑底1-2個(gè)數(shù)量級(jí)。
8.送譜。收集的產(chǎn)品旋干，在送譜前通常需要重結(jié)晶。如果樣品太少或?yàn)橐后w，可過一小凝膠柱，作為送譜前的最后純化手段?？沙渥V1.5ppm左右所謂的“硅膠”峰。

 

注意事項(xiàng)
1.先根據(jù)TLC方法篩選好洗脫劑，使兩相鄰物質(zhì)Rf值之差最大化
2.將柱子必須裝平整、均勻
3.考慮有限柱填料的吸附量

4.可考慮用梯度法分開并洗脫

 

快速柱色譜(Flash Column Chromatography)是一種快速而且（通常是）容易的分離復(fù)雜混合物的方法。柱色譜和薄層色譜的原理一樣，但它可以用于制備量物質(zhì)的分離。因?yàn)槲覀兪怯脡嚎s空氣將溶劑推過柱子，故稱其為快速柱色譜。這不僅使分離效果更好，并且可縮短過柱時(shí)間。

 

制備和操作快速柱色譜：

1）確定干燥、不含溶劑的待分離混合物的重量。

 

2）用薄層色譜選取溶劑體系，使Rf的值處于0.2～0.3之間，但如果混合物復(fù)雜，這可能不現(xiàn)實(shí)。在比較復(fù)雜的情況下，可能需要借助梯度洗脫的方式，簡單地說，就是在純化洗脫的過程中不斷提高溶劑的極性，該技術(shù)在后面有更加詳盡的介紹。但是在薄層色譜分析中，你必需確定哪種溶劑體系將會(huì)使不同的點(diǎn)樣處于Rf在0.2～0.3的范圍之內(nèi)。

 

3）確定用于樣品上柱的方法。你可有三種選擇：凈試樣法，溶液法或硅膠吸附法。

凈試樣法：如果樣品是非粘性油狀物，使用凈試樣法最為容易。你可以用一個(gè)長的滴管過濾器將液體引入柱中，然后用預(yù)先確定的溶劑體系進(jìn)行淋洗，把所有組分洗入柱子中。

溶液法：凈試樣法有時(shí)可能會(huì)引起分離柱斷層。因此，對(duì)于液體和固體，更為普遍的方法是將樣品溶于溶劑中，然后將溶液加入分離柱。最理想的狀態(tài)是，混合物中所有組分在該溶劑體系（通常是戊烷或己烷）中的Rf為0。這在多數(shù)情況下是難以實(shí)現(xiàn)的，所以可選用那種只移動(dòng)混合物中一個(gè)化合物的溶劑，或者你可以簡單地用所選擇的洗脫液。記?。汉竺鎯煞N選擇對(duì)于難度較大的分離純化是有風(fēng)險(xiǎn)的。

硅膠吸附法：最后一個(gè)技術(shù)是將化合物沉積（吸附）到硅膠上，這對(duì)部分液體和所有固體都是有用的。注意：硅膠是酸性的，因此這一步驟將會(huì)破壞一些對(duì)酸敏感的化合物，它們通常需要在硅膠柱上再生。首先，在一圓底燒瓶中將混合物溶解在二氯甲烷中，加入硅膠（硅膠的質(zhì)量大約是化合物質(zhì)量的兩倍）。在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上濃縮該溶液。注意：硅膠是非常細(xì)的粉末，很容易被吸入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中。用玻璃毛塞住接頭或泵的保護(hù)裝置，以防止固體被吸入泵中?？焖俎D(zhuǎn)動(dòng)亦可以避免這個(gè)問題的出現(xiàn)。當(dāng)固體基本上干燥的時(shí)候（當(dāng)多數(shù)固體從容器壁上脫落，說明固體已經(jīng)干燥），從旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上卸下燒瓶，再用真空泵將溶劑抽盡（假設(shè)混合物中沒有易揮發(fā)性物質(zhì)）。注意：用玻璃毛塞住真空泵接頭，否則你可能會(huì)發(fā)現(xiàn)硅膠（以及你的化合物）進(jìn)入真空管并沉積在那里。一旦其完全干燥之后（固體中再?zèng)]有氣泡產(chǎn)生），從真空系統(tǒng)中取下燒瓶，用干凈的刮刀從壁上刮下固體?，F(xiàn)在，你可以簡單地用粉末漏斗將這部份固體加到分離柱的頂端，然后用洗脫液淋洗（每次1.5mL）?！竞唵瘟苏f就是硅膠拌樣時(shí)，防爆球口塞上棉花之類的東西，要不產(chǎn)品就會(huì)隨著硅基進(jìn)水泵了】

 

4）確定合適的硅膠和化合物的比例。對(duì)于簡單的分離，通常要求兩者的比例為30~50：1（重量比）；但對(duì)比較困難的分離，需要的比例高達(dá)120：1。和一些經(jīng)驗(yàn)豐富的同事進(jìn)行討論，將對(duì)你解決這個(gè)難題大有裨益。

 

5) 選取合適的分離柱。你所需用的硅膠量決定了分離柱的尺寸。是使用短而粗還是長而細(xì)的分離柱，迄今為止還沒有定論。我們認(rèn)為短而粗的分離柱會(huì)有更好的分離效果，但是這個(gè)結(jié)論可能會(huì)被你以后的一些同事所質(zhì)疑。當(dāng)你首次開始實(shí)驗(yàn)的時(shí)候，最好的選柱方法是向?qū)嶒?yàn)室的同事了解：對(duì)給定的硅膠量，應(yīng)選擇怎樣的分離柱！把結(jié)論記在筆記本上（這比測(cè)量分離柱的直徑方便很多）。

 

6) 選取合適的收集用試管。這也是一個(gè)向有經(jīng)驗(yàn)的同事們請(qǐng)教的好機(jī)會(huì)。但也有簡單的方法：將硅膠體積除以4，然后選取能裝下這個(gè)體積的試管就可以了。（200mL的硅膠對(duì)應(yīng)于50mL的組分）

 

7) 一旦你選定了分離柱，你需要堵住活塞底端以避免硅膠的流失。通常，用一小團(tuán)棉花或者玻璃毛加一根長棍或玻璃棒即可完成?！粳F(xiàn)在都是用磨砂底的硅膠柱，直接可以用了】

 

8) 在通風(fēng)櫥中填充分離柱?？紤]到要用大量揮發(fā)性溶劑，以及干燥硅膠對(duì)于健康的危害，不允許在通風(fēng)櫥外進(jìn)行柱的操作。檢查并確定柱子是否完全垂直，傾斜的柱子不利于分離。

 

9）關(guān)上活塞并且加上幾英寸高的洗脫液。

 

10) 用漏斗向分離柱中加入一些沙（干燥并且經(jīng)過洗滌的）。目的是在塞堵物上鋪一薄層砂（不超過1cm），這樣可以避免硅膠落入收集瓶中。

 

11) 量取合適量的硅膠，最安全的方式是在通風(fēng)櫥中量取。硅膠的密度大約是0.5 g/mL，因此可以直接用錐形瓶量?。?00g＝200mL）。不要讓硅膠的體積超過燒瓶的1/3，因?yàn)槲覀冞€要在其中加入溶劑。

 

12) 在剛量取的硅膠中加入至少1.5倍體積的溶劑，將其制成漿狀，用力振蕩和強(qiáng)烈攪拌，使其充分混合，并且除去硅膠中的氣體（氣泡的存在將會(huì)使分離柱的效率大打折扣）。

 

13) 用粉末漏斗小心緩慢地將漿狀物移入分離柱中，注意不要破壞下面的沙層。注意在灌漿的過程中不時(shí)地停下來并且搖動(dòng)漿體，以確保硅膠混合均勻。灌漿結(jié)束后，用洗脫液反復(fù)沖洗燒瓶幾次，并且將余下的溶劑硅膠混合物加入到分離柱中。

 

14) 用滴管和洗脫液將黏附在柱子頂部邊緣上的硅膠沖洗到溶劑層中。

 

15) 當(dāng)所有的硅膠都被洗離柱壁，打開活塞，用壓縮空氣給柱加壓。柱內(nèi)的硅膠將會(huì)壓縮到原來高度的一半左右。檢查以確保柱子的頂段平坦，如果不平，必需重新攪拌，然后沉降下來。在加壓下，加入過量的洗脫液，用鉛筆頭或橡皮塞輕輕地從敲打柱子，這將使硅膠顆粒填充得更加緊密。收集從柱子中流出的所有洗脫液，在加入化合物之后重復(fù)使用。

【注意：切記不要讓溶劑液面低于填充層?！?/span>

 

16）當(dāng)柱子填充好以后，在硅膠的頂部加入沙子作為保護(hù)層。沙層需要填充的比較平整，厚度約在2cm左右。這在添加溶劑時(shí)起到保護(hù)柱子的作用——當(dāng)溶劑加入過快時(shí)，如果沒有沙層的保護(hù)，溶劑可能會(huì)破壞填充硅膠的平整的表面（因此影響分離效果）。

 

17）在溶劑還沒有達(dá)到沙層之前，可以用壓縮空氣促使溶液層下降。

 

18）關(guān)閉活塞，將第一個(gè)試管放在柱子的出口下面。

 

19）小心地向分離柱中加入你的化合物——當(dāng)添加液體時(shí)，確保是沿柱子的壁面加入，而不要直接滴加在柱的頂段。當(dāng)沖洗含有混合物的燒瓶時(shí)，小心地一次性地將滿滿一滴管淋洗液加到分離柱中。然后打開活塞，當(dāng)液體下降到填充物的頂段時(shí)關(guān)掉活塞。如此沖洗燒瓶三次。對(duì)沉積在硅膠上的混合物，還要再加2cm厚的保護(hù)沙層。

 

20）小心地在分離柱中加滿洗脫液。開始時(shí)可以用巴斯德球管加入溶劑。當(dāng)加入了1cm高度的溶劑之后，最好打開活塞。繼續(xù)用滴管滴加溶劑，直到溶劑高于柱內(nèi)的填充層幾個(gè)厘米。現(xiàn)在，可以通過一個(gè)粉末漏斗從錐形瓶中加入溶劑了——緩慢地讓它沿柱子壁加入。一定要有耐心，不要破壞柱內(nèi)填充物的頂段。

 

21）當(dāng)把洗脫液裝滿分離柱之后，你就可以開始“過柱”了。請(qǐng)記住快的流速將使分離更好地進(jìn)行。調(diào)整空氣壓力使達(dá)到一個(gè)快的流速——但不能象消防籠頭那么快！保持壓力，在收集試管裝滿后換上一支新的試管。注意隨時(shí)向柱內(nèi)補(bǔ)充溶劑。

 

22) 用TCL跟蹤柱子的分離進(jìn)程。一邊收集樣品，一邊進(jìn)行薄層色譜分析。這一點(diǎn)可能帶來一些忙亂，因此，你若要觀察色譜柱工作進(jìn)展情況，則在一開始便可以減低氣壓（甚至完全去除）。

 

23）當(dāng)操作梯度洗脫時(shí)，先用一種溶劑以保證具有較大Rf的化合物先從柱中被洗脫。當(dāng)他們被安全地洗脫到收集燒瓶之后，便可以更換一種極性更大的溶劑繼續(xù)洗脫。注意：逐步提高溶劑的極性。過于急速的極性變換可能會(huì)使硅膠分裂——就像電影里可怕的地震場(chǎng)面一樣，柱內(nèi)的填充層出現(xiàn)裂縫。這對(duì)你的分離將會(huì)非常不利！因此，以每100mL（或更多）溶劑中增加5％左右的極性，直至達(dá)到所希望的溶劑。然后，用該種洗脫液洗脫，直到目標(biāo)化合物被洗脫出來。這個(gè)時(shí)候，你可以繼續(xù)更換洗脫液或者直接進(jìn)行下一步。

 

24）當(dāng)你確定所有目標(biāo)化合物都已經(jīng)從柱內(nèi)被洗脫的時(shí)候，你就可以將每樣?xùn)|西收拾起來了。首先，在分離柱的底端放置一個(gè)大燒瓶，然后用一個(gè)夾子切斷聯(lián)通分離柱的壓縮氣體的氣路。讓氣體將剩余的溶劑全部壓出柱子，然后干燥硅膠（從分離柱中移出硅膠比較困難，除非它是完全干燥的）。對(duì)于大的分離柱，這個(gè)過程差不多要耗費(fèi)一個(gè)小時(shí)。

 

25）當(dāng)分離柱在干燥之時(shí)，可開始將組分合并起來。用薄層色譜來確定哪個(gè)試管中含有所需的純樣品。將相似純度的組分合并放在大的圓底燒瓶中，并用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進(jìn)行濃縮。對(duì)于費(fèi)時(shí)較長的柱子，可在柱分離過程中就合并流出的組分，以加速進(jìn)程。

 

 

26）當(dāng)完全除去溶劑后，就可以用NMR分析所得到的化合物了。