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有關(guān)物質(zhì)含量的計算方法對于有關(guān)物質(zhì)的計算，首先需要明確的是對各特定雜質(zhì)的指認，雜質(zhì)指認主要采用雜質(zhì)對照品進行定位或相對保留時間兩種方法，用雜質(zhì)對照品進行指認最為準確。當雜質(zhì)對照品不易獲得或需檢測的雜質(zhì)較多時，可用相對保留時間的方法對雜質(zhì)進行定位，如《中國藥典》2015年版二部中有近450個品種的有關(guān)物質(zhì)檢查項下采用了相對保留時間的方法對雜質(zhì)進行定位，但用相對保留時間定位也是存在一定風(fēng)險的，尤其是對于梯度洗脫。雖然有如此多的品種用相對保留時間對雜質(zhì)進行指認，但《中國藥典》2015年版中并未對相對保留時間的計算做出規(guī)定，EP與USP對此做出了說明。相對保留時間分為校正的相對保留時間與未經(jīng)校正的相對保留時間，校正的相對保留時間即目標峰與主成分峰的絕對保留時間均扣除死時間后的比值，而未經(jīng)校正的相對保留時間即為目標峰與主成分峰絕對保留時間的比值，由于校正的相對保留時間每次都需測定死時間，EP與USP均規(guī)定如無特殊規(guī)定正文中的相對保留時間均指未經(jīng)校正的相對保留時間。然而由于儀器和色譜系統(tǒng)之間的差異，即使采用相同的色譜柱，未經(jīng)校正的相對保留時間往往也會有可能變動，尤其是對于梯度洗脫，為了提高相對保留時間的重現(xiàn)性，質(zhì)量標準中可以采用校正的相對保留時間對雜質(zhì)進行指認。

(1)外標法

采用雜質(zhì)對照品法對已知雜質(zhì)進行測定，這一方法專屬性好，數(shù)據(jù)也最準確。但是除了原料合成中的中間體外，其他雜質(zhì)對照品不易獲得，價格昂貴。另外，有些不穩(wěn)定的雜質(zhì)，比如5-羥甲基糠醛，無法制備穩(wěn)定的雜質(zhì)對照品，也難以采用此方法。

(2)歸一化法

歸一化法通常指的是面積歸一化法，該法的前提是假設(shè)所有雜質(zhì)在既定的色譜條件下均能夠被分離洗脫且有響應(yīng)，高低濃度均在線性范圍內(nèi)并響應(yīng)因子一致。該方法不需要對照品，如果滿足假設(shè)條件，這一方法最為簡單、準確、重現(xiàn)。但是當各雜質(zhì)與主成分的響應(yīng)值差異較大時，可能超出線性范圍，因此對微量雜質(zhì)的檢查應(yīng)格外注意。

(3)自身對照法

自身對照法就是通過雜質(zhì)峰的面積與規(guī)定濃度主成分稀釋溶液(一般是0.1％或0.5%)的峰面積比較，測定雜質(zhì)的含量。

與歸一化法一樣，這一方法的優(yōu)點同樣是不需要雜質(zhì)對照品，主要是克服了由于高低濃度的線性問題帶來的誤差，在國內(nèi)藥品標準中大多采用這一方法。

但是該方法同樣也不能克服響應(yīng)因子不同造成的誤差，比如苯丙醇有關(guān)物質(zhì)的檢查(圖14-10),HPLC歸一化法和自身對照法的純度都低于95%，苯丙醇中的主要雜質(zhì)是苯丙酮，通過GC-MS和HPLC-MS分析證實樣品中的雜質(zhì)為苯丙酮，外標法測定結(jié)果表明苯丙醇中苯丙酮的含量只有0.18%。由于苯丙酮和苯丙醇的響應(yīng)因子之間的巨大差異導(dǎo)致了外標法與自身對照和歸一化法結(jié)果之間的差異。

圖14-10 苯丙醇有關(guān)物質(zhì)檢查

1．苯丙醇；2．苯丙酮

在不考慮線性和響應(yīng)因子的情況下，與歸一化法相比，由于樣品中雜質(zhì)的存在，使自身對照溶液的濃度在計算中會引人誤差，而且隨雜質(zhì)量的增加，計算結(jié)果與真實值之間的偏離就越大，從而過高地判斷產(chǎn)品中的雜質(zhì)。以單一雜質(zhì)為例，假定藥物A中只含有一種雜質(zhì)B，在測定條件下A的進樣濃度在線性范圍內(nèi)，且雜質(zhì)B和主成分A的響應(yīng)因子相同，計算如表14-4所示，從模擬數(shù)據(jù)的比較可以看出，自身對照法測定結(jié)果的相對偏差隨著雜質(zhì)實際含量的增加而線性增加(圖14-11)。好在化學(xué)藥品的純度一般都比較高，上述誤差在實際工作中并不明顯。

表14-4 自身對照法與歸一化法雜質(zhì)含量測定結(jié)果間的差異

圖14-11 自身對照法測定結(jié)果與實際含量的相對偏差

(4)加校正因子的自身對照法或面積歸一化法

將各已知雜質(zhì)的峰面積用校正因子校正后，再采用主成分自身對照法或面積歸一化法計算，可有效排除雜質(zhì)響應(yīng)因子不同對結(jié)果的影響，該方法正被在國內(nèi)外藥典越來越普遍地采用。

(5)主成分對照品外標法

主成分對照品外標法包括加不校正因子的主成分對照品外標法和加校正因子的主成分對照品外標法。操作、計算分別與不加校正因子和加校正因子的主成分自身對照法基本一樣，唯一不同的是前者要用主成分對照品制備一個濃度與雜質(zhì)限度相當?shù)娜芤鹤鳛閷φ掌啡芤? 后者是由供試品溶液直接稀釋得到一個濃度與雜質(zhì)限度相當?shù)娜芤鹤鳛閷φ杖芤骸?/span>

由于主成分對照品是經(jīng)過標定的，具有確定的純度，因此其計算結(jié)果較主成分自身對照法更為準確。《中國藥典》2015年版中尚未收錄該法，但USP與EP中的品種大多采用加校正因子或不加校正因子的主成分對照品外標法計算雜質(zhì)的含量。