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大多數(shù)小分子藥物是酸性或堿性化合物，它們常常帶有各種官能團，如羥基、胺類、磺酸、 吡啶、咪唑等。對于這些可解離化合物在反相色譜中的保留與流動相的PH值有著密切的關(guān)系。如何正確選擇流動相pH在藥物反相色譜分析方法開發(fā)中非常關(guān)鍵，可幫助分析人員減少試錯時間和物質(zhì)成本，從而提高工作效率。

 

01、幾個基本概念

 

緩沖溶液

 

緩沖溶液指的是指由弱酸及鹽、弱堿及其鹽組成的混合溶液，能在一定程度上抵消、減輕外加強酸或強堿對溶液酸堿度的影響，從而保持溶液的PH值相對穩(wěn)定。

 

緩沖容量

 

緩沖容量是指使單位體積緩沖溶液的PH改變1個單位時，所需加入的強酸、強堿的物質(zhì)的量。是衡量緩沖溶液緩沖能力大小的尺度。單位mol/L pH或mmol/L pH。

 

pH

 

氫離子濃度指數(shù)（hydrogen ion concentration）是指溶液中氫離子的總數(shù)和總物質(zhì)的量的比。

 

pKa

 

酸度系數(shù)以符號pKa來表示：當(dāng)溶液中藥物離子濃度和非離子濃度完全相等，即各占50%時，溶液的PH值稱為該藥的解離常數(shù)（pKa）。

 

一般來說，較大的Ka值（或較小的pKa值）代表專較強的酸，屬這是由于在同一的濃度下，離解的能力較強。

 

利用酸度系數(shù)，可以容易的計算酸的濃度、共軛堿、質(zhì)子及氫氧離子。如一種酸是部分中和，Ka值是可以用來計算出緩沖溶液的pH值。

 

 

02、如何選擇緩沖液pH值

 

在選擇緩沖液pH值之前，應(yīng)先了解被分析物的pKa，高于或低于pKa兩個單位的值，有助于獲得良好的峰形，溶液pH值高于或低于兩個pKa單位，化合物99%以一種形式存在，才能獲得好的尖銳的峰。

 

（一）考察離子化合物的pKa值

 

在反相色譜分析中通常不要求化合物精確的pKa值，我們可以通過查閱文獻或者根據(jù)化合物的結(jié)構(gòu)按照下圖中列出的主要酸堿官能團在水溶液的pKa值進行推測。

注意：按照上表中官能團進行估算時分子中相鄰基團的不同會導(dǎo)致pKa出現(xiàn)1~2個單位的差異。對于酸性化合物，當(dāng)含有吸電子基團時會導(dǎo)致酸性增強，pKa值相應(yīng)降低；對于堿性化合物，當(dāng)含有吸電子基團時會導(dǎo)致堿性降低，pKa值相應(yīng)降低。

 

（二）根據(jù)化合物pKa值推測流動相相應(yīng)使用的pH

 

先看下流動相pH對酸堿化合物的影響：

1. 流動相pH對不同pKa化合物的保留時間的影響

根據(jù)這幅圖，我們可以看出，當(dāng)流動相的pH約等于化合物的pKa時，可以最大限度的調(diào)整化合物的保留時間。此時改變0.1個單位的pH可以使得保留因子k變化10%，可引起分離度±2.5個單位的變動。但此時需要進行精確控制流動相的pH，這要求把流動相pH控制在0.02個單位以內(nèi)，在實驗室很難控制，重現(xiàn)性較差，成為分析的瓶頸。

 

但我們實驗時可以將pH范圍放寬，只要將流動相pH控制在化合物pKa值±1.5個單位的范圍內(nèi)（上圖所示的II范圍內(nèi)）就可以對化合物保留行為產(chǎn)生比較明顯的影響，此時進行分離選擇性較好。同時為了更好地控制保留行為的重現(xiàn)性，需要控制緩沖液的pH在±0.1個單位以內(nèi)（當(dāng)流動相pH控制范圍較窄時建議使用緩沖鹽的質(zhì)量進行控制，比pH計進行控制效果更優(yōu)）。

 

通過以上三點分析我們可以得出，待分析化合物的pKa與確定流動相的pH有很大的關(guān)系。主要依據(jù)化合物出峰時間、化合物的峰型及所需要分離目標(biāo)的化合物綜合考慮來確定流動相的pH。

 

可能有的實驗人員會發(fā)現(xiàn)第二點和第三點是有些矛盾的，這時候就需要對自己的實驗進行初步的探索，看看是否pH值會對化合物的峰型產(chǎn)生影響（有的專家認為該觀點缺乏理論和實踐的支持）或者是否需要準(zhǔn)確調(diào)節(jié)pH在化合物pKa±1.5范圍內(nèi)進行提高選擇性。

 

在實驗時發(fā)現(xiàn)有的物質(zhì)會因稀釋液pH使用不當(dāng)產(chǎn)生峰分叉的現(xiàn)象，調(diào)節(jié)稀釋液的pH即可解決峰的分叉；有時流動相pH在化合物的pKa±2的范圍內(nèi)時離子化合物并沒有出現(xiàn)峰分叉、峰型不好現(xiàn)象。

 

（三）根據(jù)流動相pH值選擇所需要的緩沖鹽

 

緩沖液選擇主要依據(jù)：

 

1、緩沖溶液的pKa和緩沖容量

 

一般緩沖溶液的pKa值與流動相的pH相等時緩沖能力最大，pKa與流動相的pH相差越大，緩沖液的緩沖能力越差。一般要求流動相的pH與緩沖液的pKa值不能超過±1.0個單位，當(dāng)緩沖溶液濃度較高時可以放寬范圍到1.5個單位。常用的緩沖液的緩沖范圍見下圖：

緩沖溶液的濃度一般在5-50mmol/L，因過低導(dǎo)致緩沖能力不足（可通過調(diào)整進樣體積查看化合物峰型的變化，如果出現(xiàn)拖尾或者前沿現(xiàn)象，說明緩沖溶液的能力不足）；緩沖液濃度過大會導(dǎo)致與有機相混溶時鹽的析出，對儀器、色譜柱都會產(chǎn)生損傷，而且使得基線不好。

 

2、溶解度

 

在酸性緩沖溶液中，如磷酸鹽，緩沖液溶解度順序：鈉鹽＜鉀鹽＜銨鹽；有研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)pH=7時10mmol/L的磷酸鉀在85%甲醇或者75%乙腈中可以溶解，在pH=3時，在85%甲醇或者85%乙腈中可以完全溶解（此測試通過使用容器將不同比例的混合溶劑進行混合，觀察大約30min，是否有沉淀產(chǎn)生，否則就要降低緩沖液的濃度或者有機相的含量，在梯度洗脫時尤為注意）。

 

3、紫外吸收

 

在pH≤3.5，6.0≤pH≤8.5或者pH≥11.0磷酸鹽緩沖液是不錯的選擇。而甲酸鹽和乙酸鹽緩沖液的范圍是2.5～6.0，適用于210納米或者更高吸收的檢測波長。

 

緩沖鹽的種類或者濃度對選擇性的改變會很小，只是起到緩沖作用，提高化合物的保留時間的穩(wěn)定性。在高效液相色譜法中，分離酸或堿緩沖溶液對維持流動相恒定pH和提高保留時間的重現(xiàn)性都非常重要。

 

選擇合適的緩沖鹽需要考慮pKa和緩沖容量、溶解度、紫外吸光度（使用UV檢測器）、揮發(fā)性（MS蒸發(fā)光散射檢測器）、離子對性質(zhì)、穩(wěn)定性和儀器的兼容性。流動相緩沖容量取決于緩沖鹽的pKa，緩沖鹽濃度，流動相pH。當(dāng)緩沖液中溶質(zhì)的的兩種形態(tài)（HA和 A-）濃度相等時，即緩沖鹽的pKa與流動相pH相等時，緩沖能力最大。當(dāng)流動相的pH與緩沖鹽的pKa相差越大，緩沖鹽的緩沖容量就越小。因此緩沖的pKa與流動相的pH相差不能超過±1.0個單位。

 

流動相的緩沖容量一般與緩沖液濃度成正比關(guān)系，通常濃度范圍5~25mmol/L。樣品溶解在流動相中可以避免在反相色譜過程中發(fā)生緩沖能力的問題，尤其是流動相緩沖液濃度較低或注入樣品量較大的時候。

 

當(dāng)緩沖容量偏低時，可以從以下方面調(diào)節(jié)緩沖容量：