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嘉峪檢測網(wǎng) 2020-11-28 17:42
一、前言
遺傳毒性雜質(zhì)（Genotoxic Impurities，GTIs），也稱基因毒性雜質(zhì)，是指能引起遺傳毒性的雜質(zhì)，包括致突變雜質(zhì)和其他類型的非致突變雜質(zhì)。其中，致突變雜質(zhì)（Mutagenic Impurities）指在較低水平時(shí)也能直接引起DNA損傷，導(dǎo)致DNA突變，從而可能引發(fā)癌癥的遺傳毒性雜質(zhì)[1]，其致突變致癌作用機(jī)制目前一般認(rèn)為是線性機(jī)制。致突變性(Mutagenicity)通常由標(biāo)準(zhǔn)的細(xì)菌回復(fù)突變試驗(yàn)（Ames試驗(yàn)）結(jié)果判定，致癌性（Carcinogenicity）由動(dòng)物致癌試驗(yàn)結(jié)果和人類致癌性相關(guān)證據(jù)判定。非致突變性遺傳毒性雜質(zhì)不直接作用于DNA，一般引起染色體畸變，通常為閾值機(jī)制，即化合物劑量與效應(yīng)之間的關(guān)系不完全是線性的，在濃度達(dá)到一定閾值后才產(chǎn)生相應(yīng)的毒性作用。閾值機(jī)制的存在可能是化合物在與DNA接觸前即被降解失活，或產(chǎn)生的損傷一定程度內(nèi)可被有效修復(fù)[2]。隨著科學(xué)研究的深入，逐步發(fā)現(xiàn)閾值機(jī)制在非致突變（如苯胺）和致突變（如甲磺酸乙酯EMS）致癌物中都存在。閾值機(jī)制在《Genotoxic Impurities：Strategies for Identification and Control》[3]一書第7章節(jié)有詳細(xì)闡述。ICH M7和中國藥典2020版四部通則9306均關(guān)注致突變機(jī)制的遺傳毒性雜質(zhì)，非致突變機(jī)制的遺傳毒性雜質(zhì)以一般雜質(zhì)水平存在時(shí)，通?？珊雎云渲掳╋L(fēng)險(xiǎn)。
二、法規(guī)發(fā)展歷程
自2000年起，藥監(jiān)機(jī)構(gòu)相繼發(fā)布相關(guān)文章或指導(dǎo)原則，要求原料藥和制劑廠商對遺傳毒性雜質(zhì)進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)控制。如下為主要的法規(guī)發(fā)展歷程：
2000年，歐洲藥典公開發(fā)表文章，提出磺酸在醇溶液中成鹽可能產(chǎn)生磺酸酯類雜質(zhì)；
2002年，CPMP（Committee for Proprietary Medicinal Products, 歐洲專利藥品委員會(huì)），現(xiàn)為CHMP（Committee for Human Medicinal Products，人用藥品委員會(huì)），發(fā)布《Position paper on the limits of GIs》，提出閾值機(jī)制和線性機(jī)制，需要對遺傳毒性雜質(zhì)進(jìn)行質(zhì)量（Quality）和安全性（Safety）評(píng)估；
2004年， 《Guideline on the Limits of GIs-draft》發(fā)布，提出ALARP（As Low As Reasonably Practical，合理可行的最低程度）原則和TTC (Threshold of Toxicological Concern，毒理學(xué)關(guān)注閾值)概念；
2006年，PhRMA（Pharmaceutical Research and Manufacturers of America，美國藥品研究和制造商協(xié)會(huì)）發(fā)布白皮書，提出分期TTC（Stage TTC）概念，并將遺傳毒性雜質(zhì)分為5類，將定量構(gòu)效關(guān)系（Quantitative Structure Activity Relationships, QSAR）評(píng)估作為遺傳毒性雜質(zhì)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的第一步；
2006年，EMA發(fā)布首個(gè)正式指南《Guideline on the Limits of Genotoxic Impurities》，2008年由CHMP安全工作組（SWP）發(fā)布Q&A，提出決策樹；
2008年，F(xiàn)DA發(fā)布《Genotoxic and Carcinogenic Impurities in Drug Substance and Products: Recommended Approach》；
2017年，ICH發(fā)布指南《M7(R1) Assessment and Control of DNA Reactive(Mutagenic) Impurities in Pharmaceuticals to Limit Potential Carcinogenic》；
2020年，中國藥典2020版四部通則9306 遺傳毒性雜質(zhì)控制指導(dǎo)原則隨藥典發(fā)布正式公開。
隨著相關(guān)科學(xué)研究的深入，已發(fā)布的指南也會(huì)逐步優(yōu)化調(diào)整，繼續(xù)協(xié)調(diào)企業(yè)與監(jiān)管機(jī)構(gòu)之間的不同意見。
三、風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估過程
遺傳毒性雜質(zhì)的研究是綜合學(xué)科，涉及有機(jī)化學(xué)（產(chǎn)生和清除機(jī)理）、生物化學(xué)（致突變致癌機(jī)理）[4]、毒理學(xué)（體內(nèi)體外遺傳毒性試驗(yàn)、致突變和致癌性數(shù)據(jù)評(píng)估等）、計(jì)算機(jī)分子模擬（軟件預(yù)測）、制藥工藝（合成路線篩選、遺傳毒性雜質(zhì)的工藝控制等）、分析化學(xué)（產(chǎn)品檢測）等；因此，在ICH指南中不屬于Q3系列，歸類在M系列下（Multidisciplinary Guidelines）。原料藥或制劑產(chǎn)品中遺傳毒性雜質(zhì)的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估過程也會(huì)涉及上述各學(xué)科知識(shí)。同樣的，監(jiān)管機(jī)構(gòu)審評(píng)過程中涉及到非臨床安全性數(shù)據(jù)（實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)、計(jì)算機(jī)預(yù)測數(shù)據(jù)及相關(guān)文獻(xiàn)可靠性評(píng)估、AI和PDE計(jì)算等）部分由藥理毒理專業(yè)審評(píng)；確定AI或PDE后，結(jié)合每日最大給藥劑量和用藥周期確定的限度、相關(guān)的分析檢測方法學(xué)和工藝控制策略由藥學(xué)專業(yè)審評(píng)。
對遺傳毒性雜質(zhì)進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估時(shí)，需考慮到產(chǎn)品所處的不同開發(fā)階段。處于臨床I期的產(chǎn)品和申報(bào)上市的產(chǎn)品，在遺傳毒性雜質(zhì)的工藝控制、限度確定、檢測方法開發(fā)等要求上是不同的，大致可按如下風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估流程進(jìn)行：
第一步，列出產(chǎn)品工藝路線中的所有可能雜質(zhì)，不限于起始物料、中間體、試劑、催化劑、溶劑、可能的反應(yīng)副產(chǎn)物（尤其是最后一步反應(yīng)）、降解產(chǎn)物（來自強(qiáng)制降解、長期和加速穩(wěn)定性試驗(yàn)、制劑工藝過程或原輔料相容性試驗(yàn)）等；代謝產(chǎn)物和制劑降解產(chǎn)物需要另行考慮，這些雜質(zhì)大部分時(shí)候也是中間體或起始物料，在原料藥合成路線設(shè)計(jì)時(shí)就需要考慮到可能產(chǎn)生遺傳毒性雜質(zhì)的代謝途徑和降解途徑，并盡量避免。代謝產(chǎn)物和制劑降解產(chǎn)物的研究控制在《Genotoxic Impurities：Strategies for Identification and Control》[3]一書第6章節(jié)和第15章節(jié)有詳細(xì)闡述，此處不再贅述。
第二步，采用數(shù)據(jù)庫/文獻(xiàn)檢索、QSAR評(píng)估、體外遺傳毒性試驗(yàn)（通常是細(xì)菌回復(fù)突變試驗(yàn)）、體內(nèi)遺傳毒性試驗(yàn)等方法對上述化合物進(jìn)行遺傳毒性結(jié)構(gòu)評(píng)估；充分利用可靠文獻(xiàn)和軟件預(yù)測進(jìn)行評(píng)估，盡量減少動(dòng)物試驗(yàn)。按照標(biāo)準(zhǔn)流程進(jìn)行的細(xì)菌回復(fù)突變試驗(yàn)需要至少300mg各化合物，某些難以獲得的雜質(zhì)用于該試驗(yàn)可能比較困難。基于結(jié)構(gòu)的評(píng)估可以有效預(yù)測細(xì)菌回復(fù)突變試驗(yàn)結(jié)果，即上述的可靠的文獻(xiàn)檢索（致癌性和致突變性毒理學(xué)數(shù)據(jù)）和QSAR評(píng)估。
1）文獻(xiàn)檢索
可靠的化合物致癌性和致突變性毒理學(xué)文獻(xiàn)檢索首先來源于可靠的數(shù)據(jù)庫或?qū)I(yè)網(wǎng)站上經(jīng)過各學(xué)科專家組織充分評(píng)估過的與普通人群暴露（食物、水、空氣等）相關(guān)的安全性數(shù)據(jù)。遺傳毒性雜質(zhì)在藥學(xué)領(lǐng)域是較新的概念，但是相關(guān)化合物在環(huán)保、化學(xué)危險(xiǎn)品、人類健康等領(lǐng)域已有多年毒理學(xué)研究數(shù)據(jù)積累。以下是常用的數(shù)據(jù)庫或檢索網(wǎng)站：
IARC（International Agency for Research on Cancer，國際癌癥研究署）是世界衛(wèi)生組織下屬的一個(gè)跨政府機(jī)構(gòu)，進(jìn)行世界范圍內(nèi)的癌癥流行病學(xué)調(diào)查和研究工作，從1971年起組織專家組收集和評(píng)價(jià)世界各國有關(guān)化學(xué)物質(zhì)對人類致癌危險(xiǎn)性的資料，其分類網(wǎng)站（https://monographs.iarc.fr/list-of-classifications）定期更新化合物致癌性分類，最新的分類標(biāo)準(zhǔn)詳見表1。該分類與遺傳毒性雜質(zhì)的分類不同，只針對致癌性進(jìn)行分類，ICH M7中的遺傳毒性雜質(zhì)基于致癌性和致突變性進(jìn)行分類。
表1 IARC化合物致癌性分類
| 類別 | 定義 | 分類標(biāo)準(zhǔn) |
| 1類 | 對人具有致癌性 | 有足夠的證據(jù)證明對人類具有致癌性；人類暴露有強(qiáng)有力的證據(jù)，同時(shí)在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中顯示出重要的致癌物特征和足夠的致癌性證據(jù)。 |
| 2A類 | 對人很可能是癌 | 進(jìn)行至少兩次下列評(píng)價(jià)，包括至少一次涉及人體和人體細(xì)胞或組織的評(píng)價(jià):1.人類致癌性證據(jù)有限；2.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有足夠的致癌證據(jù)；3.強(qiáng)有力的證據(jù)顯示具有致癌物質(zhì)的關(guān)鍵特征；這類物質(zhì)或混合物對人體致癌的可能性較高，在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)充分的致癌性證據(jù)，對人體雖有理論上的致癌性，但實(shí)驗(yàn)性的證據(jù)有限。 |
| 2B類 | 對人可能致癌 | 該類別存在下列評(píng)價(jià)之一的情況:1.人類致癌性證據(jù)有限；2.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中有足夠的致癌證據(jù)；3.強(qiáng)有力的證據(jù)表明具有致癌物關(guān)鍵特征(無論是暴露于人類還是人體細(xì)胞)。 |
| 3類 | 對人的致癌性尚無法分類 | 不屬于以上任何類別的因素通常被放在這個(gè)類別中。當(dāng)在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和人類致癌性證據(jù)均不足時(shí)，通常放在此類別；當(dāng)有強(qiáng)有力的證據(jù)表明在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中有致癌性機(jī)制但不能在人類身上起作用，在人類身上的證據(jù)還不夠時(shí)，也可放在此類別中。 |
ToxInfo（毒理學(xué)數(shù)據(jù)網(wǎng)絡(luò)，https://www.toxinfo.io/）是美國國立醫(yī)學(xué)圖書館（National Library of Medicine, NLM）建立的門戶網(wǎng)站，由涉及毒理學(xué)、危險(xiǎn)化學(xué)品、環(huán)境衛(wèi)生等相關(guān)領(lǐng)域的數(shù)據(jù)庫構(gòu)成，由NLM的專業(yè)信息服務(wù)部執(zhí)行的毒理學(xué)和環(huán)境衛(wèi)生信息計(jì)劃來管理。ToxInfo提供了對下列數(shù)據(jù)庫的免費(fèi)訪問檢索：HSDB、ChemIDplus、CTD、CPID、Haz-Map、IRIS、ITER、CCRIS、CPDB、GENE-TOX。其中我們常用的是CPDB、IRIS、CCRIS、GENE-TOX、HSDB、ITER。
CPDB(Carcinogenic Potency Database，致癌性數(shù)據(jù)庫)，由加利福尼亞大學(xué)和勞倫斯伯克利實(shí)驗(yàn)室開發(fā)，收錄了自1950年代以來進(jìn)行的6540項(xiàng)慢性、長期動(dòng)物癌癥實(shí)驗(yàn)結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)化分析，只提供1980~2011年間的信息，現(xiàn)已不再更新。CPDB收錄的毒理學(xué)數(shù)據(jù)（鼠傷寒沙門氏菌Ames試驗(yàn)結(jié)果、不同種屬動(dòng)物的TD50等）被各國藥監(jiān)機(jī)構(gòu)廣泛認(rèn)可，可直接使用，一般選擇最低的TD50值進(jìn)行AI（Acceptable Intakes，可接受攝入量）值計(jì)算。
IRIS（Integrated Risk Information System, 綜合風(fēng)險(xiǎn)信息系統(tǒng)）是美國環(huán)境保護(hù)署（Environmental Protection Agency, EPA）開發(fā)的一個(gè)人類健康評(píng)估計(jì)劃，評(píng)估暴露于環(huán)境污染導(dǎo)致對于健康的影響（癌癥和非癌癥）的情況，收錄的化學(xué)品信息都經(jīng)過了EPA科學(xué)家們的審定，并代表了EPA的結(jié)論性意見。IRIS除了對特定化合物的不同致癌性和致突變性毒理學(xué)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行專業(yè)評(píng)估匯總，也會(huì)提供明確的用于計(jì)算參考劑量（Reference Dose, RfD）的NOEL（No-Observed Effect Level，未觀察到作用水平）、NOAEL(No-Observed Adverse Effect Level，未觀察到有害作用水平)或LOEL（Lowest-Observed Effect Level，觀察到作用的最低水平）、相應(yīng)于1/100000風(fēng)險(xiǎn)水平的飲用水限度或吸入劑量等數(shù)值，可用于計(jì)算可接受攝入量，權(quán)威性和認(rèn)可度較高。
CCRIS（Chemical Carcinogenesis Research Information System，化學(xué)致癌研究信息系統(tǒng)）由美國國立癌癥研究所（National Cancer Institute，NCI）開發(fā)和維護(hù)，收錄了9000多種致癌性、致突變性、誘發(fā)腫瘤和抑制腫瘤的試驗(yàn)結(jié)果的化學(xué)品記錄，只提供1985~2011年間的信息，現(xiàn)已不再更新。CCRIS羅列文獻(xiàn)發(fā)布的致癌性和致突變性簡單試驗(yàn)過程和試驗(yàn)結(jié)果（陰性或陽性），未提供直觀的TD50、NO(A)EL、LOEL等數(shù)據(jù)，這些試驗(yàn)結(jié)果經(jīng)常不一致，需要專業(yè)的毒理學(xué)人員對試驗(yàn)過程合理性進(jìn)行判斷，質(zhì)量研究人員只能參考。
GENE-TOX(Genetic Toxicology Data Bank, 遺傳毒理學(xué)數(shù)據(jù)庫)由美國環(huán)境保護(hù)署創(chuàng)立，收錄3200多種化學(xué)品的經(jīng)專家審評(píng)的遺傳毒理學(xué)試驗(yàn)（含致突變性）結(jié)果，只提供1991~1998年間信息，現(xiàn)已不再更新。同CCRIS一樣，只羅列簡單的動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果，僅供參考。
HSDB（Hazardous Substances Data Bank, 危險(xiǎn)物質(zhì)數(shù)據(jù)庫）收錄了5800多種危險(xiǎn)化學(xué)品的毒理學(xué)數(shù)據(jù)，提供了充分的參考文獻(xiàn)，并且經(jīng)過科學(xué)審查小組的評(píng)審。Section 5下提供的毒理學(xué)試驗(yàn)總結(jié)中也能找到NO(A)EL、LOEL值，可靠性上可能不如IRIS提供的結(jié)果，僅供參考。
ITER（International Toxicity Estimates for Risk，國際毒性風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估）提供來自全球各權(quán)威機(jī)構(gòu)的600多種環(huán)境關(guān)注化學(xué)品的健康風(fēng)險(xiǎn)值和癌癥分類，用表格形式對比不同機(jī)構(gòu)（CDC/ATSDR、Health Canada、RIVM、 US EPA、IARC、NSF International等）的數(shù)據(jù)差異，并作出解釋，提供來源文獻(xiàn)和更詳細(xì)的說明鏈接。我們可以在這個(gè)數(shù)據(jù)庫中找到化合物的各類權(quán)威毒理學(xué)試驗(yàn)結(jié)果，并直觀看到數(shù)據(jù)比較，最終選擇哪個(gè)數(shù)據(jù)進(jìn)行限度計(jì)算還需要專業(yè)毒理學(xué)人員充分合理評(píng)估。
ToxInfo提供的上述數(shù)據(jù)庫，沒有毒理學(xué)專業(yè)知識(shí)的質(zhì)量研究人員用的比較多的還是CPDB和IRIS，能獲得直觀的TD50計(jì)算AI或NO(A)EL等計(jì)算PDE。
其他可靠網(wǎng)站和數(shù)據(jù)庫還有：Carcinogenicity Database (Lhasa Ltd.)、ATSDR、IPCS、CalEPA、NTP等。
Carcinogenicity Database（https://carcdb.lhasalimited.org/carcdb-frontend/）由Lhasa Ltd.公司開發(fā)，提供比CPDB更加詳細(xì)的TD50值獲得的試驗(yàn)過程。Lhasa Ltd.公司也開發(fā)了Derek、Meteor、Vitic和Zeneth等預(yù)測軟件，其中Derek被藥監(jiān)機(jī)構(gòu)廣泛認(rèn)可。
ATSDR（Agency for Toxic Substances & Disease Registry，有毒物質(zhì)和疾病登記局）是美國健康和公共服務(wù)部門下屬的聯(lián)邦公共健康機(jī)構(gòu)，預(yù)防與有毒物質(zhì)有關(guān)的有害暴露和疾病，提供經(jīng)專家小組評(píng)估過的毒理學(xué)數(shù)據(jù)匯編（Toxicological Profiles），該網(wǎng)站下（https://www.atsdr.cdc.gov/mrls/mrllist.asp#169tag）定期更新有毒物質(zhì)的不同給藥途徑下的急慢性動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果MRLs（Minimal Risk Levels，最小風(fēng)險(xiǎn)劑量）值，類似于EPA提出的參考劑量（RfD），是無健康風(fēng)險(xiǎn)的暴露劑量的估算值，具體是指人類在確定的時(shí)間內(nèi)每日接觸有害物質(zhì)而不產(chǎn)生明顯的非致癌性損害作用的劑量。該值可靠性高，可計(jì)算PDE值。
IPCS（International Programme on Chemical Safety，國際化學(xué)品安全規(guī)劃小組）由世界衛(wèi)生組織、國際勞工組織和聯(lián)合國環(huán)境規(guī)劃署共同成立的有關(guān)化學(xué)品安全的國際合作機(jī)構(gòu)，開展化學(xué)品對人體健康和環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)的評(píng)價(jià)，包含動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果、人體和環(huán)境暴露及安全性評(píng)價(jià)，其網(wǎng)站也會(huì)公布特定化合物的CICAD（Concise International Chemical Assessment Document, 簡明國際化學(xué)品評(píng)估文件）及可接受攝入量（https://www.who.int/ipcs/publications/cicad/cicads_alphabetical/en/）,國際認(rèn)可度高，可參考使用。
CalEPA（California Environmental Protection Agency, 加利福尼亞州環(huán)境保護(hù)局）提供毒理學(xué)試驗(yàn)結(jié)果和直觀的口服或吸入斜率因子（Slope Factor）和NSRL（No Significant Risk Level，無顯著風(fēng)險(xiǎn)水平），可直接作為特定化合物的可接受攝入量。網(wǎng)址鏈接：https://calepa.ca.gov/，搜索欄中直接輸入CAS號(hào)即可。
NTP（National Toxicology Program，美國國家毒理計(jì)劃），提供各化合物的毒理學(xué)研究結(jié)果，網(wǎng)址鏈接：https://ntp.niehs.nih.gov/，搜索欄中直接輸入CAS號(hào)即可。
上述各數(shù)據(jù)庫或網(wǎng)址均是被國際廣泛認(rèn)可的權(quán)威性安全性數(shù)據(jù)檢索來源，某些化合物相關(guān)研究較多，各網(wǎng)站均能提供相關(guān)毒理數(shù)據(jù)，此時(shí)需要對不同網(wǎng)站檢索到的毒理學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行試驗(yàn)過程合理性評(píng)估，最好由毒理學(xué)專業(yè)人員進(jìn)行。某些化合物所能檢索到的毒理學(xué)數(shù)據(jù)較少，當(dāng)上述網(wǎng)站都沒有相關(guān)信息時(shí)，可嘗試在google中檢索“CAS號(hào) EPA”，也能獲得US EPA公布的信息。
文獻(xiàn)檢索和結(jié)果分析需要一定時(shí)間，大量的英文文獻(xiàn)和毒理學(xué)專業(yè)術(shù)語可能有些費(fèi)勁，對安全性數(shù)據(jù)的評(píng)估也需要毒理學(xué)專業(yè)人員參與，此時(shí)采用QSAR方法對化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)評(píng)估就顯得簡單一些。
2）QSAR評(píng)估
ICH M7推薦采用2種互補(bǔ)機(jī)理的QSAR毒性預(yù)測方法，如基于專家規(guī)則的Derek（Lhasa Ltd.開發(fā)， FDA、EMA推薦使用）、Compact、OncoLogic等；基于統(tǒng)計(jì)學(xué)的Sarah、Topkat (Accelrys Inc.)等。上述軟件的毒理學(xué)數(shù)據(jù)均是來自化合物實(shí)際Ames試驗(yàn)結(jié)果，通過專家系統(tǒng)知識(shí)或已有的毒理學(xué)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，建立模型對待測物進(jìn)行毒性預(yù)測。軟件預(yù)測的靈敏度（sensitivity）和特異性(specificity)在苯胺或氮雜芳胺類遺傳毒性雜質(zhì)的評(píng)估上有一定缺陷，不過會(huì)隨著實(shí)際化合物Ames試驗(yàn)結(jié)果和更精準(zhǔn)的警示結(jié)構(gòu)的不斷補(bǔ)充逐步提高，使用者需特別關(guān)注這類雜質(zhì)的評(píng)估結(jié)果。企業(yè)也可以采用自行開發(fā)的軟件進(jìn)行毒性評(píng)估，但所采用的方法需遵循經(jīng)濟(jì)合作與發(fā)展組織（OECD）制定的一般驗(yàn)證原則[5]，且應(yīng)使用2014年M7發(fā)布之后開發(fā)的模型進(jìn)行預(yù)測。
如果經(jīng)2種互補(bǔ)的QSAR方法預(yù)測均沒有警示結(jié)構(gòu)，可以確定該化合物沒有致突變性，可以歸類為遺傳毒性雜質(zhì)分類列表中的第5類雜質(zhì)。如果長期給藥的雜質(zhì)日攝入量大于1mg，不管分類如何，都應(yīng)進(jìn)行最低篩選要求的遺傳毒性試驗(yàn)（點(diǎn)突變和染色體畸變）。任何陽性或相互矛盾的結(jié)果可以通過專業(yè)知識(shí)（與具有細(xì)菌回復(fù)突變試驗(yàn)數(shù)據(jù)且結(jié)構(gòu)相似的類似物比較、由專家對化學(xué)結(jié)構(gòu)進(jìn)行評(píng)價(jià)以確定化合物是否具有DNA反應(yīng)性、采用相同方法的其他經(jīng)驗(yàn)證的QSAR模型論證等）或開展遺傳毒性試驗(yàn)進(jìn)行充分合理論證。當(dāng)軟件評(píng)估的結(jié)果與藥監(jiān)機(jī)構(gòu)或ICH等權(quán)威國際組織發(fā)布的數(shù)據(jù)或Ames試驗(yàn)結(jié)果沖突時(shí)，以藥監(jiān)機(jī)構(gòu)和權(quán)威國際組織公布的結(jié)果或Ames試驗(yàn)結(jié)果為準(zhǔn)。
3）遺傳毒性試驗(yàn)評(píng)估
遺傳毒性試驗(yàn)方法有多種，根據(jù)試驗(yàn)檢測的遺傳終點(diǎn)，可將檢測方法分為3大類，即基因突變、染色體畸變、DNA損傷；根據(jù)試驗(yàn)系統(tǒng)，可分為體內(nèi)試驗(yàn)和體外試驗(yàn)。體外試驗(yàn)通常有細(xì)菌回復(fù)突變試驗(yàn)（即Ames試驗(yàn)，推薦使用，至少應(yīng)包含5種菌株組合：TA98、TA100、TA1535、TA1537或TA97或TA97a、TA102或大腸埃希桿菌WP2 uvrA或大腸埃希桿菌WP2 uvrA（pKM101），沒有特殊說明時(shí)，一般為鼠傷寒沙門氏菌）、體外中期相染色體畸變試驗(yàn)、體外微核試驗(yàn)、小鼠淋巴瘤L5178Y細(xì)胞Tk基因突變試驗(yàn)（MLA）等；體內(nèi)試驗(yàn)通常有轉(zhuǎn)基因突變試驗(yàn)、Pig-a試驗(yàn)（外周血）、微核試驗(yàn)（外周血和骨髓）、大鼠肝臟非程序性DNA合成(UDS)試驗(yàn)、堿性彗星試驗(yàn)等。上述各試驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)方法詳見ICH S2 《人用藥物遺傳毒性試驗(yàn)和結(jié)果分析指導(dǎo)原則》[6]。
QSAR結(jié)果不明確或者為3類時(shí)，可以進(jìn)一步開展細(xì)菌回復(fù)突變試驗(yàn)或其他體外遺傳毒性試驗(yàn)；體外結(jié)果為陽性時(shí)，可以進(jìn)一步開展體內(nèi)遺傳毒性試驗(yàn)，明確體內(nèi)致突變風(fēng)險(xiǎn)，指導(dǎo)限度制定。其他體內(nèi)外遺傳毒性試驗(yàn)的選擇應(yīng)根據(jù)雜質(zhì)的反應(yīng)機(jī)理和預(yù)期靶組織暴露的知識(shí)進(jìn)行科學(xué)論證，且試驗(yàn)設(shè)計(jì)應(yīng)參考ICH S2 《人用藥物遺傳毒性試驗(yàn)和結(jié)果分析指導(dǎo)原則》[6]。
第三步，當(dāng)完成上述文獻(xiàn)檢索或軟件評(píng)估過程后，需要根據(jù)檢索/評(píng)估的結(jié)果，即是否具有明確的致突變和致癌性數(shù)據(jù)，對各化合物進(jìn)行分類，具體分類標(biāo)準(zhǔn)和M7推薦的控制策略見表2[2]。
表2 ICH M7 化合物致癌性和致突變性分類
| 分類 | 定義 | 擬定的控制措施 |
| 1 | 已知致突變致癌物 | 控制不超過該化合物特定的可接受限度 |
| 2 | 致癌性未知的已知致突變物（細(xì)菌致突變陽性，但無嚙齒動(dòng)物致癌性數(shù)據(jù)） | 控制不超過可接受限度（合適的TTC） |
| 3 | 有與原料藥結(jié)構(gòu)無關(guān)的警示結(jié)構(gòu)，無致突變數(shù)據(jù) | 控制步超過可接受限度（合適的TTC）或進(jìn)行細(xì)菌只突變試驗(yàn)；無致突變性，歸為5類；有致突變性，歸為2類 |
| 4 | 有警示結(jié)構(gòu)，且與經(jīng)測試無致突變性的原料藥及其相關(guān)化合物（例如，工藝中間體）具有相同的警示結(jié)構(gòu) | 按非致突變雜質(zhì)控制 |
| 5 | 無警示結(jié)構(gòu)，或雖有警示結(jié)構(gòu)但有充分的數(shù)據(jù)證明無致突變性或無致癌性 | 按非致突變雜質(zhì)控制 |
上述不同類別遺傳毒性雜質(zhì)可接受攝入量計(jì)算方式不同，一般可用法規(guī)公布的數(shù)據(jù)、以線性機(jī)制為基礎(chǔ)的AI計(jì)算方法、以閾值機(jī)制為基礎(chǔ)的PDE（Permitted Daily Exposure，每日允許暴露量）計(jì)算方法、TTC和分期TTC（屬于AI計(jì)算方法的一種）、其他安全性數(shù)據(jù)等計(jì)算獲得。
1）法規(guī)公布的限度
ICH M7公布了部分化合物的可接受攝入量[2]，詳見表3。FDA公布了亞硝胺類化合物的可接受攝入量[7]，詳見表4。
表3 ICH M7中的部分化合物可接受攝入量（2-1）
表3 ICH M7中的部分化合物可接受攝入量（2-2）
表4 FDA公布的亞硝胺類化合物可接受攝入量
注：當(dāng)只含有1個(gè)N-亞硝胺類雜質(zhì)時(shí)采用上述AI值計(jì)算限度，
含有2個(gè)及以上時(shí)總AI值應(yīng)為26.5ng/天。
2）AI計(jì)算方法
如果雜質(zhì)具有足夠的致癌性數(shù)據(jù)，且非閾值機(jī)制，可以采用嚙齒類動(dòng)物的TD50值通過線性外推計(jì)算化合物的AI值。TD50可從CPDB數(shù)據(jù)庫或第二步文獻(xiàn)檢索中直接獲得，也可使用與CPDB相同方法從已發(fā)表的研究中自行計(jì)算獲得，ICH M7文末舉例了具體的計(jì)算方式[8-9]。TD50的1/50,000相當(dāng)于終生潛在發(fā)生腫瘤的風(fēng)險(xiǎn)為十萬分之一。
3）PDE計(jì)算方法
PDE的計(jì)算在殘留溶劑和元素雜質(zhì)中就有廣泛運(yùn)用，當(dāng)雜質(zhì)致突變致癌作用機(jī)制為閾值機(jī)制時(shí)，可通過NO(A)EL、LOEL和不確定因子來計(jì)算PDE值。
式中，F(xiàn)1為從不同物種外推到人的因子；
F2為個(gè)體差異因子；
F3為根據(jù)毒性暴露周期采用的可變因子；
F4為根據(jù)毒性嚴(yán)重情況采用的可變因子；
F5采用NO(A)EL時(shí)，一般為1，采用LOEL時(shí)，根據(jù)毒性嚴(yán)重程度確定，最高為10。
PDE的具體計(jì)算在ICH Q3C和Q3D中有詳細(xì)舉例，式中參與計(jì)算的NO(A)EL和LOEL值單位為mg/kg/天，采用第二步文獻(xiàn)檢索時(shí)，有時(shí)候獲得的NO(A)EL和LOEL值為吸入研究的結(jié)果，單位是ppm，需要結(jié)合種屬體重和呼吸量轉(zhuǎn)換為mg/kg/天。F1~F5的具體數(shù)值需要結(jié)合獲得NO(A)EL和LOEL值的長期（慢性）動(dòng)物試驗(yàn)過程來確定。此處注意大鼠（rat）和小鼠（mouse和mice）的區(qū)別。進(jìn)行第二步文獻(xiàn)檢索時(shí)，可在IRIS、HSDB、ITER等檢索到NO(A)EL和LOEL值。
有時(shí)候NO(A)EL和LOEL值較難獲得時(shí)，也有采用LD50（50%動(dòng)物致死量）計(jì)算NOEL值的情況存在，具體公式如下：
這個(gè)公式來自于APIC《Guidance on Aspects of Cleaning Validation in Active Pharmaceutical Ingredient Plants》[10]，式中NOEL單位為mg/天，70kg為歐洲人體重，2000為口服劑型的原料藥安全系數(shù)，獲得的NOEL值進(jìn)一步用于MACO（Maximum Allowance Carryover，允許最大殘留）計(jì)算，而不是PDE計(jì)算。LD50為急性毒性試驗(yàn)結(jié)果，NOEL為長期（慢性）毒性試驗(yàn)結(jié)果，D.W.Layton等研究過從LD50→NOEL的可行性[11]，但是LD50→NOEL→PDE的過程在殘留溶劑、元素雜質(zhì)、遺傳毒性雜質(zhì)等的可接受攝入量的計(jì)算中本身存疑較多，不建議使用。
目前一般認(rèn)為，致突變雜質(zhì)直接引起DNA損傷，以線性機(jī)制為主，因此可接受攝入量計(jì)算更多還是以AI、TTC等為主，對閾值機(jī)制的研究較少，PDE計(jì)算方式的使用需要更多毒理學(xué)評(píng)估，明確閾值機(jī)制存在。
4）其他安全性數(shù)據(jù)計(jì)算可接受攝入量
除了TD50、NO(A)EL、LOEL等毒理學(xué)數(shù)據(jù)，在第二步文獻(xiàn)檢索時(shí)也能獲得化合物相應(yīng)于十萬分之一風(fēng)險(xiǎn)水平的飲用水限度（IRIS）、吸入劑量（IRIS）、MRL（ATSDR）、NSRL（CalEPA）、BMDL10等可直接或進(jìn)一步計(jì)算獲得最終的可接受攝入量。注意，應(yīng)以最新且具有科學(xué)支持的數(shù)據(jù)作為計(jì)算基礎(chǔ)。
上述各數(shù)據(jù)推導(dǎo)可接受攝入量過程舉例如下：
①當(dāng)IRIS公布的某化合物相當(dāng)于1/100,000風(fēng)險(xiǎn)水平的飲用水限度為0.1μg/L時(shí)，日飲用水量為2L/天（設(shè)定值），可接受攝入量為0.1μg/L×2L/天=0.2μg/天；
②當(dāng)IRIS公布的某化合物相當(dāng)于1/100,000風(fēng)險(xiǎn)水平的吸入暴露量為0.8μg/m3時(shí)，日呼吸量為20m3/天（設(shè)定值，有時(shí)候采用28,800L/天），可接受攝入量為
0.8μg/m3×20m3/天=16μg/天；
③采用MRL計(jì)算PDE：
PDE=MRL（mg/kg/天）×50kg，
或PDE=MRL(mg/m3)/1,000m3/L×28,800L/天
校正因子已經(jīng)包含在MRL值中，PDE計(jì)算不需要安全系數(shù)。
用于元素雜質(zhì)的可接受攝入量計(jì)算需要區(qū)分不同給藥途徑的MRL值，但是遺傳毒性雜質(zhì)除非存在特定給藥方式問題（如腫瘤的部位特異性或化合物的強(qiáng)效接觸位點(diǎn)致癌性），否則無需根據(jù)給藥途徑調(diào)整可接受攝入量，一般首選長期/慢性毒性試驗(yàn)得到的最低的MRL值。
④NSRL（如40μg/天）可以直接作為可接受攝入量；
⑤查閱的BMDL10可以直接除以10,000線性外推至十萬分之一風(fēng)險(xiǎn)發(fā)生率。
5）TTC或分期TTC
對于無毒理學(xué)研究數(shù)據(jù)的雜質(zhì)可以采用TTC（單個(gè)雜質(zhì)，1.5μg/天）作為可接受攝入量。TTC是從最敏感物種和腫瘤發(fā)生最敏感部位獲得的TD50（1.25mg/kg/天）線性外推至十萬分之一風(fēng)險(xiǎn)發(fā)生率的劑量，通用于大部分藥物。如果有2個(gè)2類或3類雜質(zhì)，應(yīng)制定每個(gè)雜質(zhì)的可接受攝入量；如果質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中有3個(gè)及以上的2類或3類雜質(zhì)，應(yīng)按表5控制總可接受攝入量。其中1類雜質(zhì)和制劑中形成的降解產(chǎn)物應(yīng)單獨(dú)控制，不計(jì)入總可接受攝入量。
短于終生給藥的藥品中致突變雜質(zhì)的TTC值可調(diào)整為更高劑量，即1.5μg/天累積70年的總量（38.3mg）平均分配到短期的總給藥天數(shù)中，具體調(diào)整見表5。間歇給藥時(shí)應(yīng)根據(jù)總給藥天數(shù)計(jì)算。
表5 單個(gè)雜質(zhì)和總雜質(zhì)的TTC和分期TTC
| 治療期 | ≤1個(gè)月 | >1~12個(gè)月 | >1~10年 | >10年~終生 |
| 單個(gè)雜質(zhì)TTC(μg/天) | 120 | 20 | 10 | 1.5 |
| 多個(gè)雜質(zhì)總TTC(μg/天) | 120 | 60 | 30 | 5 |
從TD50值推導(dǎo)的AI值，也可以根據(jù)給藥周期，按照表5的比例同等放大短期給藥的可接受攝入量，但不超過0.5%。舉例，如果終生暴露時(shí)，某化合物可接受攝入量為15μg/天，短于終生暴露時(shí)限度可增加至100μg/天（＞1~10年治療時(shí)長），200μg/天（＞1~12個(gè)月治療時(shí)長）或1200μg/天（<1個(gè)月治療時(shí)長）。但是，如果最大日服用劑量為100mg，則<1個(gè)月時(shí)長的每日可接受攝入量應(yīng)為0.5%×100mg=500μg，而不是1200μg。此方法不適用于閾值機(jī)制的PDE放寬數(shù)值，但是對于短期暴露（≤30天），具體問題具體分析后，可以提高雜質(zhì)可接受攝入量。
6）其他情況
對于與已知的某類致癌化合物在化學(xué)結(jié)構(gòu)上相似的雜質(zhì)，充分論證相似理由（結(jié)構(gòu)相似，致癌致突變機(jī)理相似）后，可以按相似化合物的可接受攝入量計(jì)算。
如果某雜質(zhì)通過其他途徑（食品、內(nèi)源性代謝物等）在人體中的暴露量更大，可接受攝入量可以提高；致突變代謝產(chǎn)物的限度制定通常需要結(jié)合體內(nèi)遺傳毒性研究結(jié)果制定，致突變制劑降解產(chǎn)物限度制定通常取決于長期穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果。
參考藥典收載的其他品種某遺傳毒性雜質(zhì)化合物的限度時(shí)需要注意，不可直接使用，應(yīng)考慮該品種的給藥周期和日服用劑量是否與待計(jì)算品種一致。
從上述各途徑獲得的雜質(zhì)可接受攝入量（AI、PDE、TTC等）計(jì)算限度如下：
式中，藥品最大日服用劑量來自藥品說明書。
第四步，按上述步驟篩選出來的遺傳毒性雜質(zhì)或潛在遺傳毒性雜質(zhì)，應(yīng)分析其在API、中間體或制劑產(chǎn)品中殘留的可能性。遺傳毒性雜質(zhì)的親電性使得它們一般具有一定化學(xué)反應(yīng)活性，詳見表6[3]。在API合成工藝中，這些雜質(zhì)可能在后續(xù)反應(yīng)步驟中去除，也可能反應(yīng)生成其他物質(zhì)，最后殘留在產(chǎn)品中的可能性較低。不過藥監(jiān)機(jī)構(gòu)不太認(rèn)可純理論分析，在雜質(zhì)控制策略中可以結(jié)合清除因子和檢測結(jié)果證明產(chǎn)品或中間產(chǎn)品中的雜質(zhì)殘留情況。
表6 遺傳毒性雜質(zhì)按化學(xué)反應(yīng)活性分類
| 化學(xué)反應(yīng)活性 | 遺傳毒性雜質(zhì)結(jié)構(gòu)類別 |
| 高活性 | 環(huán)氧化物、醛類、磺酸酯類、肼類、?；u化物、氮雜環(huán)丙烷 |
| 中等活性 | 硫芥類、氮芥類、邁克爾反應(yīng)受體、鹵代烯烴、 |
| 低活性 | 嘌呤、嘧啶、氨基甲酸酯類、芳香胺、硝基化合物 |
注：高活性指極易與親核試劑反應(yīng)。
為了量化分析雜質(zhì)殘留可能性，將雜質(zhì)的物理化學(xué)性質(zhì)和工藝過程結(jié)合起來，提出了清除因子（表7）的概念，數(shù)值越大，代表工藝清除的可能性越高。特定雜質(zhì)在特定工藝流程中的總清除因子為各步清除因子的乘積。當(dāng)清除因子大于10000時(shí)，雜質(zhì)在API中的殘留可能性極低，除非每日最大劑量在1g以上，否則可以不做相關(guān)控制；當(dāng)清除因子在100~10000之間時(shí)，需要做加標(biāo)實(shí)驗(yàn)證明工藝路線的清除能力；當(dāng)清除因子在100以下時(shí)，說明雜質(zhì)在最后或者倒數(shù)第二步引入，需要謹(jǐn)慎對待，并嚴(yán)格控制。[3,12]
表7 物理化學(xué)性質(zhì)與清除因子
| 物理化學(xué)性質(zhì) | 清除因子 |
| 化學(xué)反應(yīng)活性 | 高活性=100中等活性=10低活性=1 |
| 溶解性 | 易溶=10溶解=3略溶或不溶=1 |
| 揮發(fā)性 | 雜質(zhì)沸點(diǎn)比溶劑沸點(diǎn)低20℃以上=10雜質(zhì)沸點(diǎn)在溶劑沸點(diǎn)的±10℃范圍內(nèi)=3雜質(zhì)沸點(diǎn)在溶劑沸點(diǎn)的20℃以上或者不揮發(fā)=1 |
| 電離度 | 雜質(zhì)的潛在電離度與API或基質(zhì)明顯不同=10 |
| 柱層析 | 雜質(zhì)先于API洗脫=100雜質(zhì)后于API洗脫=10 |
| 重結(jié)晶 | 雜質(zhì)在重結(jié)晶溶劑中易溶=100雜質(zhì)在重結(jié)晶溶劑中略溶=1 |
| 其他工藝流程，如樹脂處理 | 具體情況具體分析 |
第五步，可能存在于API/制劑中的遺傳毒性雜質(zhì)，需要開展遺傳毒性試驗(yàn)確認(rèn)，通常是Ames試驗(yàn)，或者直接在各步控制在特定限度以下。
Ames試驗(yàn)結(jié)果為陰性時(shí)，按照普通雜質(zhì)控制；Ames結(jié)果為陽性，但是雜質(zhì)在產(chǎn)品或中間產(chǎn)品中能控制在特定限度以下，也可以接受；Ames結(jié)果為陽性，雜質(zhì)在限度以上，可以進(jìn)行體內(nèi)遺傳毒性試驗(yàn)，體內(nèi)結(jié)果為陰性，按一般雜質(zhì)控制；也可以重新評(píng)估工藝和路線，將雜質(zhì)控制在限度以下；如果工藝控制不能將雜質(zhì)水平降低至可接受限度以內(nèi)，而雜質(zhì)是ALARP水平，可以根據(jù)風(fēng)險(xiǎn)/收益分析合理提高雜質(zhì)限度。
基于對產(chǎn)品和工藝的理解，以及風(fēng)險(xiǎn)管理原則，可將雜質(zhì)控制點(diǎn)向上游移動(dòng)，盡量減少終產(chǎn)品檢測。ICH M7推薦4種API工藝雜質(zhì)控制方法[2]：
方法1：定入API質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)（常規(guī)檢測或定期檢測）；
方法2：工藝上游控制-定入起始物料或中間體的內(nèi)控標(biāo)準(zhǔn)；
方法3：工藝上游控制-定入起始物料或中間體的內(nèi)控標(biāo)準(zhǔn)或過程控制，限度適當(dāng)放寬，但是需要明確雜質(zhì)去向和清除信息，并確認(rèn)API中雜質(zhì)始終控制在30%可接受限度內(nèi)；
方法4：無需制定標(biāo)準(zhǔn)-明確工藝參數(shù)及其對殘留雜質(zhì)水平的影響，確信API中雜質(zhì)存在風(fēng)險(xiǎn)可忽略不計(jì)（如1%TTC[5]）。方法4適用于自身不穩(wěn)定或工藝早期引入的可被有效清除的雜質(zhì)，其可接受性由藥監(jiān)機(jī)構(gòu)根據(jù)具體問題具體分析。
對于制劑降解雜質(zhì)的控制，ICH M7建議根據(jù)降解試驗(yàn)（加速試驗(yàn)、光穩(wěn)定性試驗(yàn)、強(qiáng)制降解試驗(yàn)、原輔料相容性試驗(yàn)等）評(píng)估降解途徑與原料藥和制劑的生產(chǎn)工藝和儲(chǔ)藏條件的相關(guān)性，采取相應(yīng)措施盡量控制致突變降解雜質(zhì)產(chǎn)生和增長，雜質(zhì)限度制定取決于長期穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果。
各企業(yè)對遺傳毒性雜質(zhì)的研究和控制，可分類進(jìn)行。同一類別雜質(zhì)的致突變致癌作用機(jī)制、產(chǎn)生和清除機(jī)理、可接受攝入量制定、分析檢測方法等有一定相似性，在項(xiàng)目運(yùn)行過程中收集各品種的各類遺傳毒性雜質(zhì)信息，逐步建立企業(yè)自己的遺傳毒性雜質(zhì)庫，在后續(xù)同類別遺傳毒性雜質(zhì)研究和控制中可以節(jié)約時(shí)間成本。
四、結(jié)語
在遺傳毒性雜質(zhì)的實(shí)際風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估過程中，目前還大量存在根據(jù)文獻(xiàn)[13]公布的警示結(jié)構(gòu)“目測”化合物（大部分時(shí)候所列出的雜質(zhì)譜清單不齊全）是否具備潛在的遺傳毒性，沒有進(jìn)行可靠文獻(xiàn)檢索和QSAR評(píng)估，根據(jù)“目測”的結(jié)果，結(jié)合用藥周期和最大日服用劑量，采用TTC或分期TTC計(jì)算出雜質(zhì)限度，開發(fā)相關(guān)方法，檢測多批次樣品，根據(jù)結(jié)果作出相應(yīng)的工藝調(diào)整，如果調(diào)整不了，尋求放寬限度的方法以使產(chǎn)品合格，完成遺傳毒性雜質(zhì)評(píng)估。這種評(píng)估方式在歐美申報(bào)中是不被認(rèn)可的，在國內(nèi)申報(bào)中也將逐步退出歷史舞臺(tái)。
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來源：上海博志研新
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