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“眾所周知，PCR是生化實驗室基本的實驗方法。”實驗結(jié)果卻總是不盡如意，有可能是PCR塑料耗材微量的污染，或者是抑制劑的引入造成的實驗干擾。還有一個很重要的原因：耗材選擇不當(dāng)也會對實驗結(jié)果造成很大的影響。

 

影響PCR實驗結(jié)果的原因有很多，通常有以下幾種。

 

1、引物：引物是PCR特異性反應(yīng)的關(guān)鍵，PCR 產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板DNA互補(bǔ)的程度；

 

2、 酶及其濃度 ；

 

3、dNTP的質(zhì)量與濃度；

 

4、模板（靶基因）核酸；

 

5、Mg2+濃度；

 

6、溫度與時間的設(shè)置；

 

7、循環(huán)次數(shù)；

 

8、設(shè)備、耗材等。

 

在眾多影響因素中，耗材是一個非常重要、也極容易被忽視的因素之一。

 

PCR耗材類型眾多：8連管、低容管、標(biāo)準(zhǔn)管、無裙邊、半裙邊，全裙邊，升孔緣等一系列的PCR及qPCR板，選擇起來非常困難，在這中間存在許多具有共性的問題，一起來看看大家在選用PCR耗材時都遇到了哪些問題，又該如何解決呢？

 

常見問題及解決辦法

 

1.PCR耗材為什么一般都是PP材質(zhì)的呢？

 

答：PCR/qPCR耗材一般都是聚丙烯（PP）材質(zhì)，因其為生物學(xué)惰性材料，表面不易于粘附生物分子，且有著良好的化學(xué)耐性，及溫度耐受性（可121℃高壓滅菌，也可以承受熱循環(huán)過程中的溫度變化）。這些材料通常會與試劑或者樣品直接接觸，因而在生產(chǎn)制備過程中需要選用高質(zhì)量的材料和良好的加工工藝。

 

2.不同體積的PCR 管/板，我該怎么選呢？

 

答：PCR管的體積大多數(shù)都可以滿足PCR反應(yīng)要求。但是在滿足實驗要求的基礎(chǔ)上，優(yōu)先推薦選用低容管。因為低容反應(yīng)管/板有著較小的上方空間，可提高熱傳導(dǎo)率并降低蒸發(fā)。而且在加樣時，需要避免加樣過量或過少。過量會導(dǎo)致熱傳導(dǎo)率下降，溢出及交叉污染，而加樣過少可能會造成樣品蒸發(fā)損失。大家可依據(jù)具體的實驗要求選用更合適的產(chǎn)品。

 

常見反應(yīng)管規(guī)格及體積：

 

單管/聯(lián)管：0.5mL，0.2mL， 0.15mL

 

96孔板：0.2mL， 0.15mL

 

384孔板：0.04mL

 

3.為何有的PCR管是平蓋，有的是凸蓋呢？

 

答：當(dāng)樣品量較少時，都會優(yōu)先選用單管或者連管。但是當(dāng)反應(yīng)體積需求較大時，單管可達(dá)到0.5mL。平蓋和凸蓋各有優(yōu)點，可參考下面的信息。

 

 

4.不同顏色的PCR管/板，我該怎么選呢？

 

答：對于普通的PCR反應(yīng)選用透明或者彩色的PCR管都是可以的，而彩色透明的PCR管更有助于進(jìn)行樣品分類管理。

 

但qPCR更推薦選用優(yōu)質(zhì)的白色PCR耗材。

 

由于qPCR需要實時定量檢測熒光信號強(qiáng)度，更需要靈敏、精確的熒光信號傳遞。與傳統(tǒng)的透明PCR產(chǎn)品相比，白色PCR產(chǎn)品可最大程度地反射熒光信號，減少孔間信號交叉污染，可優(yōu)化實時熒光定量PCR的結(jié)果。

 

5.PCR板/管材質(zhì)厚度不一，是不是厚點的穩(wěn)定性更好？

 

答：一般分為無裙邊、半裙邊、全裙邊。

 

無裙邊板：可適用于大多數(shù)的PCR儀或qPCR儀，但不適用于自動化、應(yīng)用。移液過程中穩(wěn)定性不高，需要配合板托使用。

 

半裙邊板：可適配標(biāo)簽或應(yīng)用條碼，及自動化應(yīng)用，且有著較好的移液穩(wěn)定性。

 

全裙邊板：非常適用于自動化實驗應(yīng)用，也可適配標(biāo)簽及應(yīng)用條碼。機(jī)械強(qiáng)度較好，可適用于凸出模塊的PCR儀，且移液過程中穩(wěn)定性高。

 

6.96和384孔板切角和標(biāo)識不同？

 

答：

 

A切角：PCR板的切角位置選擇取決于適配儀器要求，便于定位。

 

B標(biāo)識：PCR板的數(shù)字字母標(biāo)記有助于識別單個孔及樣品位置。一般為凸出的顏色數(shù)字標(biāo)識或者印刻標(biāo)識。對于一些自動化應(yīng)用實驗，印刻標(biāo)記的反應(yīng)板密封性會更好。

 

7.為什么有的PCR板孔緣是升起的?

 

答：常見的PCR板有平孔緣和加高孔緣兩種。

 

平孔緣的反應(yīng)板，可適用于大多數(shù)的PCR儀。

 

升孔緣的反應(yīng)板，便于封膜，可降低樣品間的交叉污染風(fēng)險。

 

8.PCR封板膜有多種類型，哪種好？

 

答：根據(jù)具體的PCR實驗要求選用適配的高質(zhì)量封板膜，不僅有效保護(hù)樣品，防止污染，還提供可信賴的實驗檢測數(shù)據(jù)。