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嘉峪檢測網(wǎng) 2020-12-18 16:40
〔摘要〕進行脫鈣處理的常規(guī)石蠟包埋組織切片，會對骨缺損修復過程中礦化程度的研究造成一定的影響，可能導致骨修復關鍵信息的丟失。在與骨整合相關的骨修復材料的實驗研究中，采用不脫鈣骨組織病理切片技術可能具有獨特的優(yōu)勢，其已被廣泛應用于骨修復材料的臨床前動物實驗研究中。該研究就含植入物不脫鈣骨組織病理切片技術及該技術在骨修復材料的骨組織工程研究中的應用情況作簡要概述。
〔關鍵詞〕不脫鈣骨組織；硬組織切磨技術；骨修復研究
對骨修復材料進行動物實驗研究時，連帶植入物進行病理組織切片，可以更好地研究植入的骨修復材料的修復效果，更利于觀察修復材料與骨組織界面的結合情況。植入的骨修復材料及骨組織的質地都很堅硬，如果使用常規(guī)石蠟包埋組織切片，需要先剔除植入物，再對骨組織進行脫鈣處理。人為剔除植入物，可能使原有的組織結構形態(tài)發(fā)生改變，對評價植入物與周邊組織的結合情況造成一定的影響，最終影響后期的評價分析；脫鈣處理會使組織細胞皺縮，同時會破壞骨的礦化結構。相較于以上技術，硬組織切磨技術具有多種優(yōu)勢：無需剔除植入物及進行脫鈣處理，植入物-組織界面不會被破壞，保持了組織與植入物之間原有的組織結構形態(tài)，且完整地保存了骨組織的礦化結構，經(jīng)染色處理后，可用于骨修復材料植入后的骨組織形態(tài)計量學及骨整合相關的研究。本研究主要介紹含植入物不脫鈣骨組織病理切片技術在骨修復材料動物實驗研究中的應用情況，以期為骨組織相關的基礎研究提供參考。
1、含植入物不脫鈣的骨組織病理切片制作技術
硬組織切磨技術主要是針對人工種植牙、骨和含植入物的骨組織、埋置有堅硬植入物的其他組織標本，或在動物實驗階段進行了親骨熒光素標記的不能進行脫鈣的骨組織，通過脫水、浸潤、包埋處理，由硬組織切磨系統(tǒng)完成的組織病理切片制作技術。利用硬組織切磨技術制備的不脫鈣骨組織病理切片，常被用于骨修復材料植入后的骨整合研究及骨形態(tài)計量分析中。
骨組織結構學研究主要借助病理染色技術進行，采用硬組織切磨技術制片的骨組織病理切片常用的組織顯色方法有蘇木精-伊紅染色（hematoxylin-eosin staining，HE 染色）法、亞甲基藍-酸性品紅染色法、Goldner's 三色染色法、甲苯胺藍染色法、Van Gieson 苦味酸-品紅染色法和茜素紅染色法。硬組織切磨技術是開展組織細胞染色技術、熒光標記技術及研究骨修復、骨代謝情況不可替代的研究方法。
2、硬組織病理切片的多種染色方法在骨組織形態(tài)學研究中的應用
2.1 HE染色法在硬組織病理切片中的應用
HE染色法（圖1）在骨組織中主要用于觀察植入界面周圍炎性細胞及巨噬細胞的浸潤情況、周邊軟組織的修復能力、植入物與骨組織的骨結合率、可降解及可吸收植入物的組織反應過程及最終的結局。嚴烏毛等[1]在延期負重加載條件下納米氟磷灰石/聚醚醚酮（nano-fluorapatite polyetheretherketone，nFA/PEEK）新型種植材料骨結合效能的研究中，將植入物植入比格犬下頜骨前磨牙區(qū)，實驗結束后將含植入物的骨組織經(jīng)光固化聚合樹脂包埋后，采用硬組織切磨技術制作不脫鈣骨組織病理切片，經(jīng)HE 染色，進行了骨結合率的測定，即在鏡下測量種植材料與骨組織接觸的長度及植入物骨內(nèi)界面的長度，然后進行統(tǒng)計學分析，結合其他實驗結果判定材料的良好生物相容性。韓雪等[2]在犬骨髓基質細胞復合納米晶羥基磷灰石/膠原/硫酸鈣（nano-hydroxyapatite/collagen/calcium sulfate hemihydrates，nHAC/CSH）裸鼠皮下成骨的實驗研究中，將構建的組織工程骨植入裸鼠皮下組織，4周后取材，制作不脫鈣骨組織病理切片，在鏡下可清楚看到 HE染色的復合體中的骨小梁、成骨細胞及破骨細胞，證明該復合體可促進骨組織的形成。HE染色法作為病理學中的基礎染色方法，能夠較好地評價種植材料的生物相容性和安全性，尤其是在含植入物的骨組織中，不脫鈣的切磨處理方式能夠最大限度地還原材料
與組織的接觸和組織反應情況。但是，HE染色法無法較全面地評價含植入物的骨組織中纖維、軟骨及新骨的形成情況，所以，對含植入物的骨組織，常結合其他特殊染色法進行分析。
圖1 羊脊椎骨植入（HE染色）
亞甲基藍-酸性性品紅染色法（圖 2）可以比較清楚地顯示骨組織中的成骨細胞、類骨質及新生骨組織，組織顏色對比明顯，較適用于測量植入物與骨結合的面積及研究骨缺損后成骨及軟組織的情況[3]。陳卿等[4]在早期負重載荷下 nFA/PEEK 成骨性能的研究中，將植入物植入比格犬下頜骨前磨牙區(qū)，實驗結束后取帶植入物的骨組織標本，經(jīng)乙醇脫水、Technovit7200 VLC 浸潤包埋后，采用硬組織切磨技術制備不脫鈣骨組織病理切片，經(jīng)亞甲基藍 - 酸性品紅染色，研究植入物骨結合形態(tài)學，染色結果顯示，原礦化骨小梁較粗大、色淺，新生骨小梁較細長、顏色較鮮艷呈深紅色、成骨細胞核呈深藍色、細胞基質呈淡藍色、類骨質呈紫灰色。于惠等[5]在不同植入扭矩的牙種植體 - 骨結合界面的組織學研究中，將BLBⅢ牙種植體植入比格犬的下頜骨，實驗結束后取帶植入體的骨組織標本行不脫鈣硬組織切磨技術進行制片，在鏡下，經(jīng)亞甲基藍-酸性品紅染色的含植入物的骨組織中可見明顯的骨基質、破骨細胞及新骨形成，且顏色區(qū)分亦較明顯。朱曉茹等[6]在采用動物模型觀察高正加速度環(huán)境對口腔種植術后種植體-骨結合的影響研究中，將種植體植入新西蘭白兔下頜切牙部位，實驗結束后取種植體及周圍骨組織標本，制備不脫鈣骨組織病理切片，通過亞甲基藍-酸性品紅染色對種植體-骨結合率進行了研究，可見亞甲基藍-酸性品紅染色對于含植入物的骨組織中的成骨細胞、骨基質等的染色效果比HE染色更加直觀，組織顏色對比更加明顯，對評價骨缺損界面骨的生長、植入物與骨組織的組織反應具有重要的意義，更適用于觀察骨結合情況。
圖2 兔股骨髁植入（亞甲基藍-酸性品紅染色）
Goldner's 三色染色法（圖3 ）較適用于骨缺損修復后新骨形成的過程觀察，在Goldner's三色染色中，礦化骨被染成綠色，類骨質被染成橙色或橙紅色，而軟骨被染成紫色或藍色。韓雪等[7]在經(jīng)微弧氧化堿熱處理后修復種植體周圍骨缺損的愈合情況的研究中，采用犬下頜前磨牙區(qū)制備骨缺損，修復種植體植入缺損區(qū)，制備不脫鈣骨組織病理切片，經(jīng)Goldner's三色染色，觀察了種植體周圍骨缺損區(qū)的修復情況。楊力碩等[8] 在自體牙骨粉與異種牛骨粉修復牙槽骨缺損的對比研究中，選取家兔上頜中切牙牙槽窩為植入部位，制備不脫鈣骨組織病理切片，采用Goldner's三色染色法，觀察了骨組織及類骨質的形成情況，在該實驗中，通過不同周期骨粉修復骨組織的Goldner's 三色染色對比，可明顯觀察到組織切磨面的新生骨組織的形成情況，在4周時，被染成藍色的新生骨面積大，而在8周和12周的切片中，被染成藍色的新生骨面積逐漸減小，被深染的成骨細胞代替，然后與對照組進行比較，評價其新骨的形成速率。Goldner's三色染色法是基于染料分子大小對結構致密、滲透性低或結構疏松、滲透性高的骨組織穿透效果不同進行染色的方法。因Goldner's三色染色法具有獨特的染色優(yōu)勢，所以被作為含植入物的骨組織的修復中比較常用的評價方法。但是，Goldner's三色染色法中，新骨的顏色與Bio-oss骨粉的成骨材料顏色相近，所以，如果植入物是Bio-oss骨粉，則在觀察骨修復時應慎重選擇此方法。
圖3 羊脊椎骨植入（Goldner's三色染色）
軟骨中含硫酸軟骨素，而甲苯胺藍屬于嗜堿性染料，軟骨細胞及其基質、成骨細胞等細胞成分會被染成藍紫色，所以甲苯胺藍染色法（圖4）適用于骨缺損修復后新、舊骨的對比觀察及對新骨數(shù)量的研究。鐘建鑫等[9]在評價多孔鉭顆粒對下頜骨骨缺損的修復效果的研究中，于比格犬下頜骨缺牙區(qū)構建頜骨骨缺損模型，將多孔鉭顆粒及Bio-oss骨粉分別植入骨缺損區(qū)，實驗結束后，制備不脫鈣骨組織病理切片，經(jīng)甲苯胺藍染色后，對骨修復材料與骨組織結合情況及周邊骨組織成熟程度進行了研究。薛喆等[10]在經(jīng)典孔隙結構鈦合金內(nèi)置物在兔肱骨近端大結節(jié)處骨長入的初步組織學研究中，將鈦合金螺釘植入制備的骨缺損模型區(qū)，實驗結束后取含植入物的骨組織標本，使用Technovit7200 VLC光固化樹脂浸潤、包埋后，利用EXAKT硬組織切磨系統(tǒng)制備不脫鈣骨組織病理切片，經(jīng)甲苯胺藍染色，觀察隨著時間的演變內(nèi)置物中骨長入的情況。靳夏瑩等[11]在評價富血小板纖維蛋白單獨用于上頜竇提升種植骨再生效果的研究中，在制備富血小板纖維蛋白后，以犬上頜第一磨牙區(qū)為研究部位，實驗結束后骨組織標本經(jīng)樹脂包埋后制備不脫鈣骨組織病理切片，經(jīng)甲苯胺藍染色，于光學顯微鏡下觀察了新骨形成情況。甲苯胺藍染色法是含植入物骨組織中非常常用的形態(tài)學及病理學研究方法，不僅可以觀察新生組織的鈣鹽沉積情況，統(tǒng)計成骨細胞數(shù)量，還常用于觀察骨缺損和樣品與組織之間的一些病理改變[12]，如能夠在鏡下看到壞死鈣化的軟骨組織及膠原纖維增生等，從而評價植入物周圍骨再生的效果及生物相容性。
圖4 兔股骨植入（甲苯胺藍染色）
Van Gieson苦味酸-品紅染色原理與染料分子大小和組織滲透有關，可將骨組織染成紅色，將膠原纖維、肌纖維等染成黃色（圖5），在骨植入實驗中用來觀察類骨質的形成及植入體與周圍骨組織的整合程度等。王勇平等[13]在探討塑料包埋技術結合四環(huán)素熒光標記制作不脫鈣骨組織切片的實驗研究中，選取兔股骨為研究部位，進行塑料包埋，制備不脫鈣骨組織切片，經(jīng)Van Gieson 苦味酸-品紅染色后顯示紅色區(qū)域為成熟骨組織，黃色區(qū)域為未礦化的類骨質。胡騰龍等[14]在顯微CT設定不同閾值范圍對評價生物活性玻璃在體內(nèi)成骨結果的影響研究中，采用新西蘭大白兔股骨髁缺損模型，植入生物活性玻璃，實驗結束后，組織標本制作為不脫鈣骨組織病理切片，經(jīng)Van Gieson 苦味酸-品紅染色，最后使用IPP軟件分析紅色部分即新生骨組織在總面積中的占比，然后進行相關性分析，探究植入物的成骨性能差異。Van Gieson 苦味酸-品紅染色由于在染色時需臨時配制，放置一段時間后酸性品紅不易著色，且切片較易褪色（應在染色后盡快保存及分析圖像），所以在實際應用中較其他特殊染色法使用頻率略少。
圖 5 兔股骨植入（Van Gieson 染色）
茜素紅屬于陰離子染料，可與諸多（鈣、鈦、鋁、鋯等）陽性金屬離子發(fā)生顯色反應，形成“鈣結節(jié)”。在骨組織中茜素紅與鈣離子形成紅色或者橘紅色的螯合物，并且顏色越深，表示該部位的骨組織鈣鹽沉積越多，所以常被用來染礦化的骨組織[15]。通過含植入物骨組織的茜素紅染色（圖6），能夠較形象地描述不同周期不同部位的含植入物骨組織中鈣鹽的沉積情況。Wise和Winkelmann[16]利用Micro-CT和茜素紅染色相結合評估了羥基脲對荷蘭兔胎兒骨骼的影響，結果顯示，Micro-CT和茜素紅染色都能夠很清晰地觀察到羥基脲對于胎兒骨骼的畸變效果，但是，Micro-CT對于鈣化程度不是很高的骨組織（邊緣位置或者新的骨組織即將形成及缺損）成像結果不明顯，而結合茜素紅染色則能夠觀察到骨組織中一些輕微的鈣化情況。
圖6 兔股骨植入（茜素紅染色）
親骨熒光素是指能夠與骨組織中鈣離子特異性結合的熒光染料，比較常用的有四環(huán)素、茜素絡合酮、鈣黃綠素（圖7）等，注入體內(nèi)后，可以與骨組織尤其是新生的骨組織相結合，經(jīng)不脫鈣硬組織切磨技術制備組織切片后，由特定波長激發(fā)，可在熒光顯微鏡下將示蹤的骨組織呈現(xiàn)出來[17]。
宋亞平等[18]在三種復合型骨移植材料早期修復骨缺損的比較研究中，于比格犬脛骨干骺端制備骨缺損，將骨修復材料植入缺損區(qū)域，實驗過程中，皮下分別注射鹽酸四環(huán)素、鈣黃綠素、茜素紅進行體內(nèi)熒光標記，實驗結束后將骨組織標本制備成不脫鈣骨組織病理切片，用于測量熒光標記率，對新生骨形成量進行了研究。周宏志等[19]在熒光標記法對“腦回形”微弧氧化表面植入物早期骨結合的評價研究中，于兔股骨髁部植入植入體，實驗過程中皮下注射鈣黃綠素，進行體內(nèi)茜素紅-鈣黃綠素雙色熒光標記，實驗結束后取骨組織標本制備不脫鈣骨組織病理切片，對骨組織礦化速率進行了研究。
圖7 股骨髁植入（茜素紅和鈣黃綠素標記）
通常情況下，在免疫組化染色中，骨組織幾乎都需要進行脫鈣處理，而對于不脫鈣骨的免疫組化染色，因制片難度高，制片方式不同于軟組織或者脫鈣后的骨組織，并且骨組織中含大量鈣鹽，所以對含植入物不脫鈣骨組織的免疫組化染色研究相對較少。然而李劍等[20] 利用改進的低溫甲基丙烯酸甲 酯（methyl methacrylate，MMA） 包埋SD大鼠脛骨，制備不脫鈣骨切片，最后進行免疫組化和原位雜交，順利觀察到了切片中的陽性表達，讓含植入物的硬組織切片的免疫組化染色成為可能。Knabe 等[21]在評價植入物的成骨性能中，利用乙醇固定取代甲醛，并用聚甲基丙烯酸甲酯和聚甲基丙烯酸丁酯混合包埋，最后進行不脫鈣的切片，經(jīng)免疫組化染色，成功檢測到了陽性信號。Yang等[22]在2019年與密歇根大學牙科學院生物與材料科學系聯(lián)合發(fā)布的一篇文章中，利用4%多聚甲醛（paraformaldehyde，PFA）固定，8%明膠包埋來處理未脫鈣的小鼠顱面組織，然后進行SOX9免疫染色、OSX和E11/Podoplanin 雙重免疫染色，均能夠在細胞中檢測到陽性表達。Fujihara 等[23]在利用未脫鈣骨組織的冷凍切片來探究異位礦化的骨組織形態(tài)學中，同樣使用免疫組化對ENPP1突變小鼠進行定量評估，其樣本用0.3% 過氧化氫處理，在用馬血清封閉后，用3,3'-二氨基聯(lián)苯胺四鹽酸鹽和過氧化氫顯色，最后獲得了具有陽性反應的切片。在硬組織的制片過程中，包埋經(jīng)常要求溫度為45~55℃，且時間較長，容易導致抗原性喪失，而通過低溫包埋或冷凍骨組織切片技術及聚甲基丙烯酸甲酯包埋甚至明膠包埋、過氧化苯甲酰等的聚合，能夠較好地維持骨組織的抗原活性，不脫鈣骨組織即能夠進行免疫組化染色，對植入材料及骨組織進行定位或定量研究具有重要的意義。但是，不脫鈣骨組織的免疫組化亦有明顯的缺點，如硬組織切片一般較厚，有時抗體無法滲透進下層組織，可能會導致染色不均或假陰性，鈣鹽的沉積也可能造成沖洗困難等，以上情況會導致整個免疫組化的染色時間及抗體量較難控制。
3、骨組織形態(tài)計量學
骨組織形態(tài)計量學是在不脫鈣骨組織病理切片技術及活體熒光標記技術的基礎上，在二維的不脫鈣骨組織病理切片圖像上利用體視學方法，推導出反映骨重建、骨結構的三維參數(shù)，即動態(tài)參數(shù)及靜態(tài)參數(shù)的研究方法，測定對象為不脫鈣的骨組織或是在動物實驗階段進行熒光標記的骨組織標本。
采用不脫鈣硬組織制片技術制備組織切片并進行形態(tài)學定量分析，可同時測定骨組織形態(tài)結構的靜態(tài)參數(shù)和動態(tài)參數(shù)。靜態(tài)參數(shù)用來描述骨量的多少和骨小梁的形態(tài)，可對描述骨小梁面積、厚度、分離度參數(shù)等信息進行定量分析。在對動物活體進行熒光標記后，可測量的動態(tài)參數(shù)包括骨吸收參數(shù)和骨形成參數(shù)，通過以上參數(shù)可以了解骨表面礦化量和礦化速率。黎永奇等[24] 在觀察HU-308藥物緩釋涂層對骨質疏松大鼠植入物周骨密度、類骨質形成和骨吸收的影響研究中，將帶植入物的大鼠脛骨制作成不脫鈣骨組織病理切片，經(jīng)甲苯胺藍染色，對骨組織形態(tài)計量學參數(shù)（植入物螺紋內(nèi)骨密度、類骨質周長百分數(shù)和骨吸收周長百分數(shù)）進行了測定、分析。
4、討論
通常情況下，對不脫鈣的骨組織及埋置有骨修復等植入物的骨組織進行病理組織切片制作，可利用EXAKT硬組織切磨系統(tǒng)[25-26]。含植入物不脫鈣骨組織病理切片技術制備的病理組織切片，保持了材料與骨結合界面的完整性，是研究結合界面的重要方法，已被廣泛應用于骨修復材料的各種動物實驗研究中，包括大動物非臨床的實驗研究。但是，其亦存在不足，如整個制片過程較為復雜，制片操作步驟煩瑣，耗時長，且成本昂貴；材料與組織之間的硬度與密度并不完全一致，在硬組織脫水、浸透、包埋處理過程中造成材料與組織界面間隙變寬或變窄，容易引起界面結合假象；相較于軟組織切片，難以把握染色過程（蝕刻過程等），想要獲得理想的染色切片具有一定的難度。
不同染色方法的特點和側重點各不相同，能夠具體應對不同的研究目的。對植入物與組織界面的研究，應根據(jù)植入物及觀察的組織不同選擇染色方法，甚至結合脫鈣骨的軟組織切片染色，以期得到可靠的形態(tài)學、組織學評價依據(jù)。武登誠和李盛林[27]在介紹口腔醫(yī)學中對硬組織切磨技術的應用中，利用 HE和甲苯胺藍染色硬組織切片，并對比觀察了植入界面的骨性接觸與纖維走向；Yang等[22]用HE染色和免疫熒光染色對比分析了抗體在組織中的具體陽性表達位點。HE染色主要是觀察植入物誘發(fā)的骨組織的組織反應，側重評價其基本的生物相容性；亞甲基藍-酸性品紅染色主要觀察成骨細胞及新生骨等，側重評價骨生成、骨結合率及計算成骨面積；Goldner's三色染色主要觀察軟骨、類骨質及礦化骨，側重骨組織修復，對于不同周期的礦化程度觀察對比明顯[28]；甲苯胺藍染色主要觀察新骨形成、骨細胞、骨基質及一些病理改變，側重骨修復觀察，而且新生骨和成熟骨之間界限清晰；Van Gieson 苦味酸-品紅染色主要觀察骨組織和膠原纖維，側重植入物與組織的整合程度；茜素紅染色主要觀察骨組織鈣鹽沉積；親骨熒光素標記主要用于示蹤，特別是對于新骨形成、骨代謝等進行定量分析；而免疫組化主要確定骨組織中的抗原，從而進行異位礦化定性、定量研究[3，29]。因每種染色方法均存在不足，所以在實際應用中應結合多種染色方法進行觀察研究。
骨修復材料的骨整合研究主要是對生物學（組織學、細胞和分子生物學）方面、醫(yī)學影像學方面及生物力學方面進行評價分析[30]。對骨組織形態(tài)結構進行分析研究的方法很多，基于影像學技術的骨組織結構形態(tài)分析方法具有無創(chuàng)、對樣本損傷小的優(yōu)點，在對骨組織性質的評價研究中優(yōu)先被選用[31]。賴春花等[32]對顯微CT與硬組織切片技術在評價牙種植體骨結合中應用的對比研究中發(fā)現(xiàn)，顯微CT可以宏觀地觀察到種植體周圍骨質的情況，但對種植體-骨界面成骨現(xiàn)象顯示不夠清晰，經(jīng)不脫鈣硬組織切片組織病理染色后其對種植體-骨界面的細微情況顯示較清晰。針對一些復雜的含植入物的骨組織，顯微CT能夠構建出三維的形態(tài)，對組織進行立體分析。Palmquist等[33]利用顯微CT及不脫鈣骨組織的甲苯胺藍染色，評估3D打印的多孔 Ti6Al4V植入的骨形成情況，發(fā)現(xiàn)通過甲苯胺藍染色的含植入物組織在定量組織形態(tài)計量學中與顯微CT的3D測量結果有高度的相關性；Liu等[34]在用形態(tài)計量學評價顯微CT能否作為松質骨的3D評估分析方法時對比了HE染色結果，利用SPSS 16.0.1軟件分析，發(fā)現(xiàn)顯微CT與組織切片在骨體積密度、骨表面密度和小梁厚度等方面具有顯著的相關性。因此，在對含植入物的骨形成研究中經(jīng)常使用組織形態(tài)學和顯微CT結合的方法來進行分析，確保結果更加可靠、立體。
盡管存在難點，但含植入物不脫鈣骨組織病理切片技術和組織染色方法已成為評價骨整合的重要研究手段和不可或缺的一部分。
【參考文獻】
［1］嚴烏毛，陳卿，魏杰，等.延期負載下nFA/PEEK種植材料的骨結合情況動態(tài)觀察[J].口腔頜面外科雜志，2017，27（5）：338-343.
［2］韓雪，周威，王東勝，等.犬骨髓基質細胞復合nHAC/CSH裸鼠皮下成骨的實驗研究[J].中華老年口腔醫(yī)學雜志，2015，13（3）：129-131.
［3］王東勝，呂燕，王興.不脫鈣骨及種植體骨磨片不同染色方法的選擇與應用[J].中華老年口腔醫(yī)學雜志，2015，13（6）：321-324.
［4］陳卿，嚴烏毛，魏杰，等.早期負重載荷下nFA/PEEK種植體周成骨情況研究[J].口腔頜面外科雜志，2018，28（2）：90-95.
［5］于惠，柳忠豪，許勝，等.不同植入扭矩的牙種植體-骨結合界面的組織學研究[J]. 中國口腔種植學雜志，2017，22（2）：57-59.
［6］朱曉茹，鄧天政，逄鍵梁.高正加速度對口腔種植體骨結合影響的動物實驗研究[J].實用口腔醫(yī)學雜志，2018，34（4）：486-490.
［7］韓雪，劉洪臣，王東勝，等.Bio-Oss與表面改性后鈦鈮鎬錫修復種植體周圍骨缺損的組織學研究[J].口腔頜面修復學雜志，2014，15（4）：207-209.
［8］楊力碩，閆建偉，鄭輝，等.自體牙骨粉與異種牛骨粉修復牙槽骨缺損的對比研究[J].華西口腔醫(yī)學雜志，2018，36（4）：372-377.
［9］鐘建鑫，節(jié)云峰，羅金英，等.多孔鉭顆粒在下頜骨缺損修復中的作用[J]. 第三軍醫(yī)大學學報，2015，37（12）：1277-1280.
［10］薛喆，宋關陽，李奉龍，等.經(jīng)典孔隙結構鈦合金內(nèi)置物在兔肱骨近端大結節(jié)處骨長入的初步組織學研究[J].中華肩肘外科電子雜志，2018，6（1）：47-52.
［11］靳夏瑩，那日蘇，鄭輝，等.評價富血小板纖維蛋白單獨用于上頜竇提升種植骨再生的效果[J].中國組織工程研究，2017，21（26）：4149-4154.
［12］潘琳，白彥萍，蔡哲，等.實驗病理學技術圖鑒[M].北京：科學出版社，2012 ：428-429.
［13］王勇平，李曉琴，張輝，等.塑料包埋結合四環(huán)素熒光標記制作不脫鈣骨組織切片的實驗研究[J].臨床與實驗病理學雜志，2012，28（5）：543-545.
［14］胡騰龍，楊柳，頡強.顯微CT設定不同閾值范圍對評價生物活性玻璃在體內(nèi)成骨結果的影響[J].骨科，2018，10（6）：539-543.
［15］Bensimon-Brito A, Cardeira J, DionísioG, et al. Revisiting in vivo staining with alizarin red S--a valuable approach to analyse zebrafish skeletal mineralization during development and regeneration[J].BMC Developmental Biology, 2016, 16: 2.
［16］Wise LD, Winkelmann CT.Evaluation of hydroxyurea-induced fetal skeletal changes in Dutch belted rabbits by micro-computed tomography and alizarin red staining[J].Birth Defects Research (Part B), 2009, 86(3): 220-226.
［17］吳濤，劉英超，郭志旺，等.親骨熒光素間接標記軟骨內(nèi)成骨的早期血管新生[J].中國組織工程研究，2017，21（8）：1192-1196.
［18］宋亞平，陳傳耀，溫璞，等.三種復合型骨移植材料早期修復骨缺損的比較[J].中國口腔種植學雜志，2018，23（2）：51-56.
［19］周宏志，劉琳，陳小冬，等.熒光標記法對“腦回形”微弧氧化表面種植體早期骨結合的評價[J].口腔頜面修復學雜志，2016，17（5）：271-276.
［20］李劍，廖二元，魏啟幼，等.不脫鈣骨組織免疫組織化學與原位雜交的方法研究[J].湖南醫(yī)科大學學報，2003，28（6）：601-604.
［21］Knabe C, Kraska B, Koch C, et al. A method for immunohistochemical detection of osteogenic markers in undecalcified bone sections[J]. Biotech Histochem, 2006, 81(1): 31-39.
［22］Yang J, Pan H, Mishina Y. Tissue Preparation and Immunostaining of Mouse Craniofacial Tissues and Undecalcified Bone[J]. J Vis Exp, 2019, 5(10): 147.
［23］Fujihara R, Chiba Y, Nakagawa T, et al. Histomorphometry of ectopic mineralization using undecalcified frozen bone sections[J]. Microsc Res Tech, 2018, 81: 1318-1324.
［24］黎永奇，李棟健，馮青，等.HU-308藥物涂層對骨質疏松大鼠種植體周骨組織影響的實驗研究[J].口腔頜面修復學雜志，2015，16（1）：14-18.
［25］齊進，黃萍，張連方，等.EXAKT 切磨系統(tǒng)在帶金屬種植體軟硬組織切片中的應用[J].中國組織工程研究，2012，16（35）：6555-6559.
［26］賀韜，曹聰，董宇啟.硬組織工程材料骨整合評價方法與應用[J].國際骨科學雜志，2012，33（2）：92-95.
［27］武登誠，李盛林.軟硬組織切磨技術在口腔醫(yī)學研究中的應用[J].北京大學學報（醫(yī)學版），2007，39（1）：94-95.
［28］范芹，徐世同，劉建國，等.3種特殊染色法顯示種植體骨磨片組織學效果比較[J].廣東牙病防治，2012，20（6）：285-287.
［29］Goldschlager T, Abdelkader A, Kerr J, et al. Undecalcified bone preparation for histology, histomorphometry and fluorochrome analysis[J]. J Vis Exp, 2010(35): S52-S58.
［30］Bloch SL, Kristensen SL, Sørensen MS. The viability of perilabyrinthine osteocytes: a quantitative study using bulk-stained undecalcified human temporal bones[J]. Anat Rec (Hoboken), 2012, 295(7): 1101-1108.
［31］呂厚辰，唐佩福.骨組織形態(tài)及微觀結構的影像學評價及進展[J].中華骨質疏松和骨礦鹽疾病雜志，2016，9（1）：68-73.
［32］賴春花，周磊，徐淑蘭，等.顯微CT與硬組織切片技術在評價牙種植體骨結合中應用的對比研究[J].口腔頜面外科雜志，2016，26（3）：195-201.
［33］Palmquist A, Shah FA, Emanuelsson L,et al. A technique for evaluating bone ingrowth into 3D printed, porous Ti6Al4V implants accurately using X-ray micro-computed tomography and histomorphometry[J].Micron,2016,11:009.
［34］Liu H, Li W, Liu YS, et al. Bone micro-architectural analysis of mandible and tibia in ovariectomised rats: A quantitative structural comparison between undecalcified histological sections and micro-CT[J]. Bone Joint Res,2016, 5(6): 253-262.
作 者：朱福余1，袁暾2，張杰3，蒲林云2，車國喜1，劉成虎1，王昕1，王閣奇3，孫立魁1（通信作者），梁潔2（通信作者），金毅4（通信作者）
單 位：1 山東省醫(yī)療器械產(chǎn)品質量檢驗中心，山東省醫(yī)療器械生物學評價重點實驗室，國家藥品監(jiān)督管理局生物材料器械安全性評價重點實驗室，國家藥品監(jiān)督管理局藥品包裝材料質量控制重點實驗室?。ㄉ綎|濟南 250101）；2 四川大學國家生物醫(yī)學材料工程技術研究中心，四川醫(yī)療器械生物材料和制品檢驗中心，國家藥品監(jiān)督管理局生物材料器械安全性評價重點實驗室?。ㄋ拇ǔ啥肌?10064）；3 深圳領先醫(yī)療服務有限公司?。◤V東深圳 518108）；4 深圳市藥品檢驗研究院·深圳市醫(yī)療器械檢測中心，廣東省藥品監(jiān)督管理局實驗病理學重點實驗室?。◤V東深圳 518057）
來源：醫(yī)療裝備雜志
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