中文字幕一级黄色A级片|免费特级毛片。性欧美日本|偷拍亚洲欧美1级片|成人黄色中文小说网|A级片视频在线观看|老司机网址在线观看|免费一级无码激情黄所|欧美三级片区精品网站999|日韩av超碰日本青青草成人|一区二区亚洲AV婷婷

本研究旨在制備具有骨誘導(dǎo)及抗菌雙重功能的多孔支架。我們首先是通過基因工程技術(shù)構(gòu)建多西環(huán)素（DOX）控制BMP2表達(dá)的骨前體細(xì)胞，再生物3D打印含活細(xì)胞的支架。支架可緩釋DOX并殺滅定植細(xì)菌，防止感染的發(fā)生；BMP2的控制表達(dá)可誘導(dǎo)細(xì)胞的成骨分化和裸鼠體內(nèi)異位成骨，并防止BMP2過度表達(dá)的不利效應(yīng)。

01、研究內(nèi)容簡介

嚴(yán)重創(chuàng)傷、骨腫瘤等臨床上常見疾病均可導(dǎo)致大段骨缺損的發(fā)生并有較高的感染風(fēng)險(xiǎn)，對其的治療仍是骨科臨床的重大挑戰(zhàn)。生物材料在骨缺損修復(fù)領(lǐng)域的應(yīng)用已有廣泛的研究，如何兼顧骨再生和控制感染的雙重需求，是近年來眾多研究關(guān)注的熱點(diǎn)。3D生物打印技術(shù)在支架制備方面具備顯著的優(yōu)勢，而基因工程技術(shù)可實(shí)現(xiàn)生長因子基因給藥的目的，避免其直接應(yīng)用所帶來的諸多限制。

如圖1所示（Fig.1），本研究利用基因工程和3D生物打印技術(shù)相結(jié)合，制備了雙功能支架：利用慢病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)，將Tet-on系統(tǒng)控制表達(dá)的BMP2基因轉(zhuǎn)染入C3H10T1/2細(xì)胞中，使細(xì)胞可在DOX的刺激下，誘導(dǎo)性表達(dá)BMP2；在生物3D打印時(shí)，先通過高溫打印擠出負(fù)載有DOX的介孔生物玻璃（MBG）與PCL的混合物，再將上述基因工程細(xì)胞負(fù)載于生物墨水中，通過低溫打印構(gòu)建與PCL/MBG/DOX的交錯(cuò)結(jié)構(gòu)。支架通過緩釋的DOX，同時(shí)實(shí)現(xiàn)骨誘導(dǎo)和抗感染功能；即DOX一方面刺激支架中負(fù)載的基因工程細(xì)胞表達(dá)并分泌BMP2，另一方面作為廣譜抗生素發(fā)揮較好的抗菌性能。

Fig. 1 The 3D-bioprinted scaffold with cells exhibiting DOX-controlled BMP2 expression. a) Construction of the transfected cells that can express BMP2 based on the Tet-on expression control system, and fabrication of 3D bioprinting scaffold that contains composite of PCL/MBG/DOX and engineering cells within the bioink. b) Mechanisms of antibacterial properties and BMP2 controlled release ability of the bioprinting dual-functional scaffold.

該基因工程細(xì)胞攜帶紅色熒光（RFP）報(bào)告基因，因此我們先利用激光共聚焦顯微鏡（CLSM）觀察不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞在支架中的存活情況。支架制備后的第1天，即可見在支架的生物墨水區(qū)域有大量的RFP信號，證明本研究采用的高溫打印與低溫打印交錯(cuò)的打印方式，仍可保證細(xì)胞在打印過程中的存活。支架在體外培養(yǎng)21天后，仍可見大量的RFP信號，表明細(xì)胞在支架內(nèi)可長時(shí)間存活；且原來無細(xì)胞的PCL/MBG區(qū)域，也可見大量RFP信號，提示細(xì)胞在支架內(nèi)部增殖并遷移（Fig. 2）。支架與細(xì)菌共培養(yǎng)研究也表明，含DOX組支架可顯著抑制表面的MRSA粘附，同時(shí)保證支架內(nèi)部細(xì)胞在感染環(huán)境下較好存活。

Fig. 2 Survival and proliferation of transfected C3H20T1/2 cells on the scaffold. Confocal microscopy images showing RFP-labeled cells in the scaffold on days 1 (a) and 21 (b).

本研究還通過Elisa實(shí)驗(yàn)證明了支架中的細(xì)胞在DOX刺激下表達(dá)并分泌BMP2（Fig. 3d）。再利用Transwell小室，將支架與BMSCs共培養(yǎng)，并通過ALP染色及茜素紅染色，證明了支架良好的誘導(dǎo)成骨分化能力（Fig. 3）。后續(xù)的裸鼠皮下異位成骨模型也證明，該支架在體內(nèi)具備較好的骨誘導(dǎo)能力。

Fig. 3 Effect of the bioprinted scaffolds on osteogenic differentiation of BMSCs. a) ALP staining after 7 and 14 days of culture. The OM group contained only osteogenic supplements. b) Alizarin Red staining after 21 days of co-culture. c) Quantitative analysis of Alizarin Red staining. d) BMP2 secretion from scaffolds according to ELISA. **p < 0.01.

研究證實(shí)該支架同樣具有良好的抗菌性。將生物熒光標(biāo)記細(xì)菌Xen29在小鼠皮下支架中接種，并通過小動物活體成像系統(tǒng)(IVIS Lumina III)觀察局部的感染進(jìn)展情況。下圖可見，相較于對照組支架，含DOX的生物打印支架具有更強(qiáng)的殺菌效果，感染局部熒光細(xì)菌的信號強(qiáng)度明顯減弱（Fig. 4）。

Fig. 4 The antibacterial activity of the bioprinted scaffolds in nude mice. a) In vivo imaging of bioluminescent signals of bacteria at days 1 and 3 after implantation, respectively. b) Quantitative analysis and comparison of bioluminescence intensity. c) Culture of bacteria released from each scaffold. *p < 0.05.

本研究的結(jié)果，證明了基因工程技術(shù)和3D生物打印技術(shù)的巧妙結(jié)合在多功能骨修復(fù)支架制備領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。在后續(xù)的研究中，我們計(jì)劃進(jìn)一步探究自體BMSCs細(xì)胞在此材料體系的應(yīng)用，并進(jìn)一步在原位感染性骨缺損動物模型進(jìn)行驗(yàn)證，為最終的臨床轉(zhuǎn)化研究提供更堅(jiān)實(shí)的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

原文信息

Minqi Wang#, Hanjun Li#, Yiqi Yang, Kai Yuan, Feng Zhou, Haibei Liu, Qinghui Zhou, Shengbing Yang*, Tingting Tang* . 

A 3D-bioprinted scaffold with doxycycline-controlled BMP2-expressing cells for inducing bone regeneration and inhibiting bacterial infection. 

Bioactive Materials 6(2021) 1318-1329.