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本研究旨在制備具有骨誘導及抗菌雙重功能的多孔支架。我們首先是通過基因工程技術構建多西環(huán)素（DOX）控制BMP2表達的骨前體細胞，再生物3D打印含活細胞的支架。支架可緩釋DOX并殺滅定植細菌，防止感染的發(fā)生；BMP2的控制表達可誘導細胞的成骨分化和裸鼠體內異位成骨，并防止BMP2過度表達的不利效應。

01、研究內容簡介

嚴重創(chuàng)傷、骨腫瘤等臨床上常見疾病均可導致大段骨缺損的發(fā)生并有較高的感染風險，對其的治療仍是骨科臨床的重大挑戰(zhàn)。生物材料在骨缺損修復領域的應用已有廣泛的研究，如何兼顧骨再生和控制感染的雙重需求，是近年來眾多研究關注的熱點。3D生物打印技術在支架制備方面具備顯著的優(yōu)勢，而基因工程技術可實現(xiàn)生長因子基因給藥的目的，避免其直接應用所帶來的諸多限制。

如圖1所示（Fig.1），本研究利用基因工程和3D生物打印技術相結合，制備了雙功能支架：利用慢病毒轉染技術，將Tet-on系統(tǒng)控制表達的BMP2基因轉染入C3H10T1/2細胞中，使細胞可在DOX的刺激下，誘導性表達BMP2；在生物3D打印時，先通過高溫打印擠出負載有DOX的介孔生物玻璃（MBG）與PCL的混合物，再將上述基因工程細胞負載于生物墨水中，通過低溫打印構建與PCL/MBG/DOX的交錯結構。支架通過緩釋的DOX，同時實現(xiàn)骨誘導和抗感染功能；即DOX一方面刺激支架中負載的基因工程細胞表達并分泌BMP2，另一方面作為廣譜抗生素發(fā)揮較好的抗菌性能。

Fig. 1 The 3D-bioprinted scaffold with cells exhibiting DOX-controlled BMP2 expression. a) Construction of the transfected cells that can express BMP2 based on the Tet-on expression control system, and fabrication of 3D bioprinting scaffold that contains composite of PCL/MBG/DOX and engineering cells within the bioink. b) Mechanisms of antibacterial properties and BMP2 controlled release ability of the bioprinting dual-functional scaffold.

該基因工程細胞攜帶紅色熒光（RFP）報告基因，因此我們先利用激光共聚焦顯微鏡（CLSM）觀察不同時間點細胞在支架中的存活情況。支架制備后的第1天，即可見在支架的生物墨水區(qū)域有大量的RFP信號，證明本研究采用的高溫打印與低溫打印交錯的打印方式，仍可保證細胞在打印過程中的存活。支架在體外培養(yǎng)21天后，仍可見大量的RFP信號，表明細胞在支架內可長時間存活；且原來無細胞的PCL/MBG區(qū)域，也可見大量RFP信號，提示細胞在支架內部增殖并遷移（Fig. 2）。支架與細菌共培養(yǎng)研究也表明，含DOX組支架可顯著抑制表面的MRSA粘附，同時保證支架內部細胞在感染環(huán)境下較好存活。

Fig. 2 Survival and proliferation of transfected C3H20T1/2 cells on the scaffold. Confocal microscopy images showing RFP-labeled cells in the scaffold on days 1 (a) and 21 (b).

本研究還通過Elisa實驗證明了支架中的細胞在DOX刺激下表達并分泌BMP2（Fig. 3d）。再利用Transwell小室，將支架與BMSCs共培養(yǎng)，并通過ALP染色及茜素紅染色，證明了支架良好的誘導成骨分化能力（Fig. 3）。后續(xù)的裸鼠皮下異位成骨模型也證明，該支架在體內具備較好的骨誘導能力。

Fig. 3 Effect of the bioprinted scaffolds on osteogenic differentiation of BMSCs. a) ALP staining after 7 and 14 days of culture. The OM group contained only osteogenic supplements. b) Alizarin Red staining after 21 days of co-culture. c) Quantitative analysis of Alizarin Red staining. d) BMP2 secretion from scaffolds according to ELISA. **p < 0.01.

研究證實該支架同樣具有良好的抗菌性。將生物熒光標記細菌Xen29在小鼠皮下支架中接種，并通過小動物活體成像系統(tǒng)(IVIS Lumina III)觀察局部的感染進展情況。下圖可見，相較于對照組支架，含DOX的生物打印支架具有更強的殺菌效果，感染局部熒光細菌的信號強度明顯減弱（Fig. 4）。

Fig. 4 The antibacterial activity of the bioprinted scaffolds in nude mice. a) In vivo imaging of bioluminescent signals of bacteria at days 1 and 3 after implantation, respectively. b) Quantitative analysis and comparison of bioluminescence intensity. c) Culture of bacteria released from each scaffold. *p < 0.05.

本研究的結果，證明了基因工程技術和3D生物打印技術的巧妙結合在多功能骨修復支架制備領域具有廣闊的應用前景。在后續(xù)的研究中，我們計劃進一步探究自體BMSCs細胞在此材料體系的應用，并進一步在原位感染性骨缺損動物模型進行驗證，為最終的臨床轉化研究提供更堅實的實驗基礎。

原文信息

Minqi Wang#, Hanjun Li#, Yiqi Yang, Kai Yuan, Feng Zhou, Haibei Liu, Qinghui Zhou, Shengbing Yang*, Tingting Tang* . 

A 3D-bioprinted scaffold with doxycycline-controlled BMP2-expressing cells for inducing bone regeneration and inhibiting bacterial infection. 

Bioactive Materials 6(2021) 1318-1329.