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本研究首次報(bào)道了基于人工合成受體可選擇性捕獲及釋放腫瘤細(xì)胞的唾液酸印跡溫度響應(yīng)性水凝膠界面。該智能水凝膠表面不僅可以通過(guò)識(shí)別腫瘤表面過(guò)表達(dá)的唾液酸分子實(shí)現(xiàn)有效捕獲真實(shí)血液中的腫瘤細(xì)胞，還可以通過(guò)降低溫度消除識(shí)別位點(diǎn)的方式來(lái)無(wú)損釋放捕獲的細(xì)胞。與傳統(tǒng)非生理兼容性的細(xì)胞捕獲與釋放，該材料其具有非侵入性的外部刺激響應(yīng)性，更高的捕獲釋放效率、細(xì)胞選擇性及穩(wěn)定性，對(duì)基于細(xì)胞的癌癥診斷具有很大的應(yīng)用前景。

01、研究?jī)?nèi)容簡(jiǎn)介

分子識(shí)別介導(dǎo)的各種細(xì)胞進(jìn)程是生理學(xué)和病理學(xué)的中心。然而，天然分子識(shí)別系統(tǒng)，如受體-配體或抗原-抗體相互作用，除了物理化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定和不易儲(chǔ)存外，它們的分離和純化通常費(fèi)時(shí)且成本較高。分子印跡技術(shù)（Molecular imprinting technology, MIT）制備的人工受體可模仿細(xì)胞過(guò)程中發(fā)生的自然分子識(shí)別，并能觸發(fā)選擇性細(xì)胞識(shí)別。唾液酸（Sialic acid, SA）是細(xì)胞膜蛋白或脂質(zhì)聚糖中的關(guān)鍵成分，腫瘤細(xì)胞表面過(guò)度表達(dá)的SA殘基提供了通過(guò)定制具有特定SA識(shí)別的MIP來(lái)產(chǎn)生細(xì)胞親和力的方法。本工作提出的具有SA識(shí)別能力的印跡水凝膠，將MIT從簡(jiǎn)單的分子分離提取應(yīng)用拓展大到選擇性細(xì)胞分離，并通過(guò)引入熱響應(yīng)性poly(N-Isopropylacrylamide) (PNIPAAm) 作為水凝膠骨架，實(shí)現(xiàn)選擇性捕獲及無(wú)損釋放腫瘤細(xì)胞（Fig.1），展現(xiàn)了MIT在醫(yī)學(xué)診療的潛力。

Fig. 1. Thermo-responsive SA-imprinted hydrogel layer enables selective capture and release of cancer cells (e.g., HepG-2, human liver carcinoma cells) through surface molecular specificity towards the overexpressed SA on the glycan terminal of cell membrane proteins.

該工作利用“三明治”結(jié)構(gòu)法，在石英片表面制備了一層微米級(jí)別的SA印跡水凝膠（Sialic acid-imprinted hydrogel, SIH），此外還制備了對(duì)應(yīng)的非印跡水凝膠NIH（Non-imprinted hydrogel）。由于SIH表面含有可特異性識(shí)別腫瘤細(xì)胞表面SA殘基的選擇性印跡空腔，因此可用于特異性捕獲過(guò)度表達(dá)SA的腫瘤細(xì)胞（Fig. 2）。

Fig. 2. Strategy to create SA-imprinted sites (i.e., SA-recognition) on thermo-responsive hydrogel layer by means of molecular imprinting on quartz substrate.

文章首先接著通過(guò)測(cè)試SIH和NIH的SA重新結(jié)合特性來(lái)確定其印跡機(jī)制。在測(cè)試濃度范圍內(nèi)，SIH水凝膠可結(jié)合的SA比相應(yīng)的NIH多（Fig. 3A）。進(jìn)一步的等溫吸附實(shí)驗(yàn)表明，在一系列的SA濃度范圍內(nèi)，與NIH相比，SIH顯示出顯著更高的SA結(jié)合能力（Fig. 3B,C）。由于這些基于PNIPAAm的水凝膠具有溫度敏感的的表面潤(rùn)濕性和內(nèi)部結(jié)構(gòu)變化特性，文章進(jìn)一步考察了它的溫度響應(yīng)性SA識(shí)別能力。在37 oC下，SIH水凝膠的SA結(jié)合能力比NIH水凝膠高2.4倍。當(dāng)溫度降低到25 oC時(shí)，SIH和NIH的SA結(jié)合力均顯著降低，并且SIH的降低幅度遠(yuǎn)大于NIH。此外，在25 oC時(shí)，SIH和NIH之間的結(jié)合能力無(wú)顯著性差異，證明得到的SIH具有溫度響應(yīng)性SA識(shí)別能力（Fig. 3D）。

Fig. 3.  (A) Equilibrium bindings of SA in PBS (10 μg/mL) on different amount of SIH or NIH. (B) Binding isotherms of SA onto SIH or NIH (24 mg/mL) in PBS over a SA concentration range of 0–40 μg/mL. (C) Scatchard analysis of the binding isotherms. (D) Thermo-responsiveness of the binding capacity.

文章隨后研究了SIH和NIH對(duì)模型腫瘤細(xì)胞HepG-2的捕獲和釋放特性。HepG-2是膜表面過(guò)度表達(dá)的一類肝癌細(xì)胞。研究發(fā)現(xiàn)，SIH和NIH上捕獲的HepG-2細(xì)胞數(shù)量均呈時(shí)間依賴性，同時(shí)發(fā)現(xiàn)具有SA印跡位點(diǎn)的SIH能夠捕獲大量細(xì)胞，與NIH上的細(xì)胞數(shù)量對(duì)比明顯更多（Fig. 4 A-B）。由于SIH中的SA識(shí)別位點(diǎn)具有溫敏性，即SIH表面在低溫（例如25 oC）下會(huì)失去其SA結(jié)合能力，因此在降低體系溫度后，30分鐘內(nèi)可以觀察到細(xì)胞從SIH表面快速脫離（Fig. 4 C-E）。這種現(xiàn)象表明具有溫度響應(yīng)性SA結(jié)合能力的SIH水凝膠層可以有效捕獲SA過(guò)度表達(dá)的腫瘤細(xì)胞，并能通過(guò)生理可接受的溫度轉(zhuǎn)變方法快速釋放它們。這一高捕獲效率和快速釋放速率的結(jié)果表明，基于MIT的溫敏性智能平臺(tái)在選擇性收集腫瘤細(xì)胞方面的潛力。

Fig. 4. Cancer cell capture and release. (A) Time-dependent cell capture by the SIH and NIH hydrogel layer (HepG-2 cell, DiO-pre-staining, green). (B) The numbers of captured HepG-2 at different time intervals. (C) Temperature-induced cell release. (D) Cell release efficiency. (E) Details of the captured cells during the capture and release process.

作者還考察了在一個(gè)捕獲/釋放周期后，所收集得到的細(xì)胞的活性變化，因?yàn)檫@是后期細(xì)胞分析腫瘤精確診斷的關(guān)鍵。作者將回收得到HepG-2細(xì)胞重新培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)它們可以重新粘附在培養(yǎng)板上，并且發(fā)現(xiàn)其細(xì)胞生長(zhǎng)行為與未經(jīng)處理的原始細(xì)胞相當(dāng)（Fig. 5A）?；钏兰?xì)胞染色結(jié)果也表明，回收的腫瘤細(xì)胞不受溫度轉(zhuǎn)變過(guò)程的負(fù)面影響。原始細(xì)胞和回收細(xì)胞并無(wú)顯著性活性差異（Fig. 5 B-C）。這進(jìn)一步證實(shí)了用于細(xì)胞捕獲和分離的熱響應(yīng)水凝膠層的非侵入性以及高度的生物相容性。

Fig. 5. The biocompatibility of thermo-responsive cell harvesting process. (A) The proliferation profiles of the original and recovered HepG-2 cells in 5 days. (B) The fluorescent images of HepG-2 cell after live/dead staining. (C) Quantitative result of live/dead cell-staining assay.

該工作進(jìn)一步在SA過(guò)度表達(dá)的HepG-2細(xì)胞和正常小鼠成纖維細(xì)胞L929細(xì)胞的細(xì)胞混合物中進(jìn)行選擇捕獲。在捕獲/釋放過(guò)程的一個(gè)周期之后，細(xì)胞混合物中HepG-2細(xì)胞數(shù)量的顯著增加（Fig. 6A）。HepG-2細(xì)胞的純度從32.5％提高到89.6％，最終可以回收超過(guò)40％的初始HepG-2細(xì)胞（Fig. 6B）。此外，以小鼠全血作為替代物，模擬癌癥患者含有循環(huán)腫瘤細(xì)胞（Circulating tumor cells, CTCs）的血液。實(shí)驗(yàn)表明，該智能捕獲平臺(tái)表面可從人工CTCs血液樣本中捕獲超過(guò)15％的摻入的HepG-2細(xì)胞，表現(xiàn)出可觀的選擇性癌細(xì)胞捕獲效率（Fig. 6 C-D）。值得一提的是，通過(guò)降低溫度，所有結(jié)合的腫瘤細(xì)胞都可從SIH表面釋放出來(lái)，展現(xiàn)出簡(jiǎn)便高效的細(xì)胞回收過(guò)程。

Fig. 6 (A) and (B) Selective cancer cell capture. (A) The fluorescent images of cell mixture of HepG-2 cells (green, DiO) and L929 cells (red, Dil) before (left) and after (right) on capture/release cycle. (C) Enumeration of the captured HepG-2 cells from artificial CTC blood sample spiked with 200 HepG-2 cells per mL. (D) The numbers of captured HepG-2 cells in three parallel trials.

總的來(lái)說(shuō)，該工作基于人工合成受體的分子識(shí)別作用，設(shè)計(jì)出可逆識(shí)別腫瘤標(biāo)記物SA的智能表面。該智能平臺(tái)具有溫度響應(yīng)性的腫瘤細(xì)胞識(shí)別能力，可通過(guò)改變溫度來(lái)選擇性捕獲和釋放SA過(guò)表達(dá)的腫瘤細(xì)胞（例如HepG-2）?？梢灶A(yù)期，這種基于MIT的可以分子識(shí)別平臺(tái)可成為一類檢測(cè)和收集CTCs乃至其他特異性細(xì)胞的的有用且通用的工具，具有很好的生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用前景。

原文信息

Yue Ma, Yimei Yin, Li Ni, Haohan Miao, Yingjia Wang, Cheng Pan, Xiaohua Tian, Jianming Pan, Tianyan You, Bin Li**, Guoqing Pan*. 

Thermo-responsive imprinted hydrogel with switchable sialic acid recognition for selective cancer cell isolation from blood. 

Bioactive Materials 6 (2021) 1308–1317.