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說到分析方法開發(fā)，目前國內(nèi)大多數(shù)研究人員面對的都是仿制藥的方法開發(fā)，也就是說有一定研究基礎(chǔ)的方法微開發(fā)。已上市的仿制藥或多或少都有一定的文獻參考，比如各國藥典、國內(nèi)外研究文獻、原研專利等等。這類方法的建立，大多基于已有的研究資料進行確認、優(yōu)化，不能稱為完整的方法開發(fā)。對于一個新的小分子原料藥，沒有可供參考的文獻時，如何進行方法的開發(fā)呢？本文以有關(guān)物質(zhì)方法開發(fā)為例，對新的小分子原料藥的方法開發(fā)思路進行了簡單的梳理，分為以下幾個部分，希望對大家有所啟發(fā)。

一 、理化性質(zhì)研究

主要包括性狀、晶型、熔點、溶解性、pKa、logP、引濕性、分子極性大小、BCS分類等。

二 、 雜質(zhì)譜分析

主要是根據(jù)合成路線來分析雜質(zhì)譜，包括工藝雜質(zhì)（中間體、副產(chǎn)物等）、殘留溶劑（合成及精制過程用到的所有溶劑）、無機雜質(zhì)（合成中用到的金屬催化劑等），降解雜質(zhì)（根據(jù)反應(yīng)機理推斷及強制降解研究來確定）。

雜質(zhì)譜分析是分析方法開發(fā)及藥物質(zhì)量標準建立的關(guān)鍵，因為研發(fā)是一個系統(tǒng)工程，需要統(tǒng)籌設(shè)計，就像QbD作為處方工藝開發(fā)的工具，指導(dǎo)我們研究的全面性，防止顧此失彼。在進行實驗前，全面系統(tǒng)的雜質(zhì)譜分析，可以讓我們?nèi)媪私饽繕朔治鑫?，做到有的放矢?/span>

當然在藥物申報過程中，我們也必須考慮到各國藥典標準的要求，需進行充分的調(diào)研，對雜質(zhì)譜進行系統(tǒng)的分析。

殘留溶劑和無機雜質(zhì)方法開發(fā)相對比較清楚，這里不做探討，主要闡述工藝雜質(zhì)和降解雜質(zhì)的有關(guān)物質(zhì)分析方法的開發(fā)。

三 、開發(fā)過程

（一）稀釋液的篩選

1 、 關(guān)鍵性能指標：對檢測無干擾、溶解性好（溶解能力大于5倍目標溶解量）、溶液穩(wěn)定（至少保證在分析檢測時間段內(nèi)是穩(wěn)定的）、無溶劑化效應(yīng)、經(jīng)濟環(huán)保等。先初篩再根據(jù)流動相考察情況調(diào)整，盡量選擇和流動相組成接近的。

2  、流動相、色譜柱、檢測波長等關(guān)鍵色譜參數(shù)的篩選

 關(guān)鍵性能指標：分離度好（主峰附近雜質(zhì)同主峰能基線分離，分離度大于1.5；已知雜質(zhì)之間能充分分離等）、主峰無雜質(zhì)包裹（峰純度符合要求）、無雜質(zhì)未保留或未洗脫、已知雜質(zhì)和未知雜質(zhì)能準確定量、各目標分析物峰型及保留時間穩(wěn)定、方法耐用性良好等。

（二）如何做？主要基于理論和實踐經(jīng)驗來設(shè)計

1  、流動相pH和緩沖鹽  對于極性分子，pH通常選擇pKa±1以外的區(qū)域，主要保障分子處在穩(wěn)定的解離狀態(tài)。緩沖鹽根據(jù)目標分析物吸收波長情況和需要的緩沖范圍來確定，比如對于低波長吸收的（220nm以下），優(yōu)先基線噪音小的磷酸鹽緩沖液，不選基線吸收大的有機緩沖鹽。

2 、 流動相有機相種類  結(jié)合目標分析物的吸收波長、洗脫難易、選擇性要求等，選擇甲醇、乙腈、四氫呋喃或者它們的混合溶液。

3  、色譜柱   色譜柱對選擇性、分離度、峰型、保留時間等方面影響最大，選擇合適的色譜柱對方法開發(fā)事半功倍?？梢愿鶕?jù)分子極性大小、分子結(jié)構(gòu)特點，色譜柱本身的性能特點（比如載碳量、比表面積、是否封尾、封尾方式、適用pH范圍、適用水相比例等），初步擬定色譜柱選擇范圍。先粗再細，并根據(jù)實驗結(jié)果靈活調(diào)整。

4  、檢測波長  波長的選擇影響到最終分析目標檢測的準確性，所以需要認真評估。一般開發(fā)方法時會使用DAD，并采用200-400nm范圍掃描，可以利用三維圖譜選擇主峰和雜質(zhì)具有等吸收的波長（即相同濃度吸收接近的波長）。但目標分析物可能數(shù)量多，結(jié)構(gòu)差異大，發(fā)色團不同，等吸收波長不容易統(tǒng)一，可能需要平衡方法策略，比如選擇雙波長、部分已知雜質(zhì)采用校正因子或外標法定量等等。

（三）是否有雜質(zhì)漏檢？分為以下幾種可能情況，這里分別闡述。

1  、雜質(zhì)極性較大、保留弱，隨溶劑峰一起洗脫

排查方法：降低洗脫強度，比如起始流動相減小有機相比例，觀察是否有雜質(zhì)多出；選擇對極性保留強的色譜柱，比如waters T3色譜柱；如果方法兼容可以采用LCMS，通過質(zhì)譜檢測器來確認溶劑峰處是否有其它物質(zhì)。

2  、雜質(zhì)包裹在主峰里面

排查方法：采用DAD檢測器，考察峰純度（對于雜質(zhì)紫外吸收圖譜同主峰接近的無法辨識）；采用LCMS，利用質(zhì)譜檢測器檢測主峰純度（可信度高）。

3  、雜質(zhì)保留在色譜柱中未洗脫出來

排查方法：增大有機相比例和延長洗脫時間（增加洗脫強度），觀察是否有新雜質(zhì)。

4  、雜質(zhì)在選定波長下無紫外吸收

排查方法：采用DAD檢測器在200-400nm范圍檢測，觀察三維圖譜是否存在新的雜質(zhì)；采用LCMS，同時對比質(zhì)譜圖和紫外圖，觀察是否有新的雜質(zhì)。

四、結(jié)語

以上是筆者對新分子原料藥方法開發(fā)思路的一個簡單梳理。實際操作中，目前儀器廠家，比如安捷倫和Waters公司都推出了專門用于分析方法開發(fā)的色譜系統(tǒng)，柱溫箱可以同時兼容多根色譜柱，流動相系統(tǒng)可以在線混合調(diào)節(jié)不同pH，檢測器配置了正交檢測器（比如DAD和質(zhì)譜檢測器）。方法開發(fā)時可以同步篩選多根色譜柱和多個不同流動相。方法開發(fā)效率得到大幅度提升，并且儀器軟件還會針對篩選的結(jié)果進行統(tǒng)計分析，給出最優(yōu)的分離條件。優(yōu)秀的硬件平臺加上先進的設(shè)計理念，方法開發(fā)工作將變得更加高效、便捷。