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細(xì)胞遷移在許多復(fù)雜的生理和病理過程中起著重要作用。傷口愈合測定是研究體外細(xì)胞遷移的簡單方法。該測定基于以下觀察：當(dāng)在匯合細(xì)胞單層上產(chǎn)生人工間隙時，所產(chǎn)生的間隙邊緣上的細(xì)胞將遷移直至建立新的細(xì)胞。

 

本應(yīng)用簡報是使用 ibidiCulture-Insert 2 Well 分析 MCF-7 細(xì)胞遷移的詳細(xì)方案。

圖 1   使用 ibidi Culture-Insert 2 Well 進(jìn)行傷口愈合測定的實(shí)驗(yàn)工作流程

ibidi Culture-Insert 2 Well 放置在細(xì)胞培養(yǎng)表面上，提供兩個細(xì)胞培養(yǎng)容器，每個容器由一條 500 μm 壁隔開。在兩個儲庫中填充細(xì)胞懸浮液僅允許細(xì)胞在指定區(qū)域生長。移除培養(yǎng)插件在適當(dāng)?shù)募?xì)胞附著后，產(chǎn)生大約 500 μm 的無細(xì)胞間隙。

 

在顯微鏡評估傷口愈合過程。根據(jù)您感興趣的焦點(diǎn)，可以通過使用視頻顯微鏡或通過在不同時間點(diǎn)觀察圖像來完成。測量細(xì)胞覆蓋區(qū)域的變化允許量化傷口閉合的速度并提供細(xì)胞遷移特征。

 

實(shí)驗(yàn)工作流程也可以應(yīng)用于 Culture-Insert 3 Well 和 Culture-Insert 4 Well。他們的區(qū)別是更多的孔和相應(yīng)的更高數(shù)量的無細(xì)胞間隙。

 

所需材料

 

細(xì)胞：MCF-7（ATCC:HTB-22；DSMZ:ACC115）

 

同一實(shí)驗(yàn)耗材：2 孔插件放在 35 毫米的培養(yǎng)皿中，高壁（ibidi，80206）

 

細(xì)胞培養(yǎng)表面：bidi ibitreat

 

細(xì)胞培養(yǎng)基：RPMI（西格瑪，R8758）=10% FCS（西格瑪，F(xiàn)0804）

 

細(xì)胞解離溶液：胰蛋白酶-ETDA（Sigma，59418C）

 

無菌鑷子

 

倒置顯微鏡，最好具有自動圖像采集系統(tǒng)和用于活細(xì)胞成像的頂部培養(yǎng)箱

 

實(shí)驗(yàn)工作流程 

 

步驟 1：細(xì)胞接種

 

為了建立可靠的數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)，您必須在開始實(shí)驗(yàn)之前定義實(shí)驗(yàn)參數(shù)。這包括例如選擇正確的細(xì)胞接種密度。我們建議使用 24 小時后產(chǎn)生 100% 光學(xué)匯合細(xì)胞層的密度。

 

1. 像往常一樣準(zhǔn)備細(xì)胞懸液。建議包括離心步驟以去除死細(xì)胞和細(xì)胞碎片。將細(xì)胞懸液調(diào)節(jié)至合適細(xì)胞濃度。在 24 小時后獲得 3×105 細(xì)胞/mL 以獲得匯合的細(xì)胞層。

 

2. 將 70 μL 細(xì)胞懸浮液應(yīng)用于 Culture-Insert 2 孔的每個孔中。避免搖動 μ-Dish，因?yàn)檫@會導(dǎo)致細(xì)胞分布不均勻。

 

3. 將細(xì)胞在 37°C 和 5%CO2 下孵育至少 24 小時。

圖 2   在 ibidi Culture-Insert 2 Well 中接種細(xì)胞

 

第 2 步：劃痕形成

 

匯合細(xì)胞層是開始該測定的先決條件。去除 Culture-Insert 2 孔后加入新鮮培養(yǎng)基。如有必要，補(bǔ)充培養(yǎng)基中的抑制或增強(qiáng)物質(zhì)，以評估其對細(xì)胞遷移行為的影響。

 

1. 在顯微鏡下 24 小時后檢查細(xì)胞密度。如果在 24 小時后沒有達(dá)到匯合的細(xì)胞層，則將 μ-Dish 再次置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中 12~24 小時，定期檢查匯合點(diǎn)。

 

2. 用無菌鑷子輕輕取出 Culture-Insert 2 孔。如圖 3 所示。

圖 3   使用無菌鑷子去除 ibidi Culture-Insert 2 孔

3. 移除插件后，檢查您的細(xì)胞層是否仍附著在 μ-Dish 的表面上。

 

4. 用無細(xì)胞培養(yǎng)基或 PBS 清洗細(xì)胞層，去除細(xì)胞碎片和非附著細(xì)胞。

 

5. 使用推薦體積為 2 mL 的無細(xì)胞培養(yǎng)基填充 μ-Dish。

圖 4   由 ibidi Culture-Insert 2 Well 創(chuàng)建的無細(xì)胞間隙

第 3 步：獲取顯微圖片

 

我們建議錄制延時視頻，以確定時間依賴性和細(xì)胞遷移的特征。

 

1. 將培養(yǎng)皿放在顯微鏡上并移動它直到你有間隙，并在圖像中捕獲兩個細(xì)胞前端。使用 4x/5x 或 10x 物鏡。傷口區(qū)域的方向并不重要，但需要水平或垂直。

 

2. 在接下來的幾個小時內(nèi)多次拍攝圖像，開始觀察過程。

 

3. 在 ibiTreat 表面上培養(yǎng)的 MCF-7 細(xì)胞的時間推移測量進(jìn)行 20 小時，時間間隔為 30 分鐘。

圖 5   使用 MCF-7 細(xì)胞的遷移測定的時間流逝測量（比例尺：200 μm）

 

步驟 4：使用 ACAS 和數(shù)據(jù)解釋進(jìn)行定量圖像分析

 

必須分析顯微照片以獲得關(guān)于培養(yǎng)細(xì)胞的遷移特征的信息。這可以通過使用圖像處理軟件手動完成，也可以使用自動圖像分析完成自動細(xì)胞分析系統(tǒng)（ACAS）由 ibidi 提供。

 

使用 ACAS 分析此處顯示的示例數(shù)據(jù)。自動圖像分析檢測細(xì)胞覆蓋區(qū)域。相對于時間繪制細(xì)胞覆蓋區(qū)域顯示了間隙閉合的過程。線性相可用于表征遷移（=傷口閉合的速度）。

 

線性相的斜率顯示平均刮擦閉合速度為 0.0184×106 μm2/小時（=0.44×106 μm2/ 天）。

圖 6   ACAS 傷口愈合實(shí)驗(yàn)的定量圖像分析