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摘要  目的：建立活血止痛類中成藥中微量元素分析和砷形態(tài)分析測定的方法，為中成藥中的質(zhì)量評價積累數(shù)據(jù)，為活血止痛類中成藥的風險防控提供數(shù)據(jù)支持。方法：采用電感耦合等離子體質(zhì)譜(ICP-MS)測定了6種活血止痛類中成藥中的16種微量元素的含量；采用高效液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜聯(lián)用法(HPLC-ICP-MS)測定了6種活血止痛類中成藥中的6種砷形態(tài)的含量。結(jié)果：Na、Ca、Se、K、Cd、Pb、Al在0.1～1.0mg·L-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，Mn、Fe、Zn、Cu、Ni、Ba、Mg、Cr、As在0.2～2.0 mg·L-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，標準曲線相關(guān)系數(shù)r均≥ 0.9997，加標回收率范圍為91.6%～97.2%，RSD<7.3%；6種砷形態(tài)在1.01～20.02ng·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，標準曲線的相關(guān)系數(shù)r均≥0.999 8，檢測限(LOD)在0.0101～0.326ng·mL-1之間，加標回收率為93.8%～98.7%，RSD<3.12%。骨折挫傷膠囊中的砷甜菜堿和砷膽堿含量最高，各為3.696 mg·kg-1和2.910mg·kg-1，五價砷含量為0.391 mg·kg-1，腰痛片中的砷形態(tài)測定結(jié)果為砷膽堿為0.476 mg·kg-1和砷甜菜堿為3.205mg·kg-1，其余品種微量檢出或者未檢出6種砷形態(tài)的含量。結(jié)論：經(jīng)初步方法學驗證，該測定方法可用于活血止痛類中成藥中的微量元素含量測定和砷形態(tài)的測定，可用于該類藥物的質(zhì)量控制。

 

關(guān)鍵詞：活血止痛；電感耦合等離子體質(zhì)譜；微量元素；砷形態(tài)

 

目前市面上活血止痛類的中成藥種類繁多，組成成份不一致，由不同的中藥材通過不同的加工而成，其中中成藥中的化學類成份研究很多，但對于其中的微量元素研究相對于少一點。隨著現(xiàn)在的分析技術(shù)越來越先進，中藥的成份研究也越來越深入，微量元素的研究更成為了熱點，并且對于一些有害元素，不僅僅是從元素含量的總量進行評估，還要從元素形態(tài)上進行分析。本次研究選擇了6種活血止痛類中成藥，該類藥品含有豐富的微量元素，其中有些元素是人體必須的元素，是人體生長代謝、身體調(diào)控機能的重要元素，比如Na、Ca、Fe、Cu、Zn、Ba、 Mg、Se、K、Mn、Al，但有些元素是有害元素，比如Ni、Cr、As、Cd、Pb等元素，這些元素如果超標，將會對人體產(chǎn)生損害，危害人的身體健康。

 

目前元素測定方法有電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜法、氫化物原子熒光光譜法、石墨爐原子吸收光譜法、火焰原子吸收光譜法、電感耦合等離子體質(zhì)譜法(ICP-MS)。本文采用ICP-MS的方法測定16種微量元素的含量，ICP-MS具有檢測靈敏度高，檢測范圍廣，檢測速度快等優(yōu)點。

 

本文建立了6種活血止痛類中成藥中Na、Ca、Mn、Fe、Zn、Cu、Ni、Ba、Mg、Cr、As、Se、K、Cd、 Pb、Al共16種微量元素含量測定研究方法，從元素總量上總體評價活血止痛類中成藥的質(zhì)量，根據(jù)測定結(jié)果發(fā)現(xiàn)有些中成藥中總砷的含量偏高，于是進行了砷形態(tài)的分析，目前發(fā)現(xiàn)的砷形態(tài)主要有6種，分別為砷甜菜堿(AsB)、砷膽堿(AsC)、一甲基砷(MMA)、二甲基砷(DMA)、三價砷(AsIII)、五價砷(AsV)，其中三價砷和五價砷是毒性最大的砷，一甲基砷和二甲基砷的毒性較弱，還有砷甜菜堿和砷膽堿是沒有毒性的。為了科學的評估活血止痛類中成藥中的砷毒性，確定其安全含量范圍，也有必要對6種砷形態(tài)進行分析。

 

1 、 儀器與材料

 

1.1  儀器

 

賽默飛ICP-RQ型電感耦合等離子體質(zhì)譜儀、Dionex Ultimate 3000高效液相色譜儀，梅特勒電子天平。

 

色譜柱為Dionex IonPac™ AS7型陰離子交換樹脂柱(4 mm×250 mm)，常州國華SHA-C型恒溫振蕩器。

 

1.2  材料

 

氬氣(純度＞99.999%，南京特種氣體有限公司)，濃硝酸(優(yōu)級純，德國Merk公司)，碳酸銨(優(yōu)級純，國藥集團)，水為超純水，砷甜菜堿(批號1904)購自于中國計量科學研究院，砷膽堿(批號，1909)、一甲基砷(批號1902)、二甲基砷(批號1909)均購自中國計量科學研究院，亞砷酸鹽As(Ⅲ)(批號144014-7)、砷酸鹽As(Ⅴ)(批號976236-2)美國O2Si smart solutions。

 

砷單元素標準溶液(批號175385-28)美國O2Si smart solutions，Na、Ca、K、Al、Cu、Mn、Mg、Cd、Zn、Fe、Ba、Se、Pb、As、Cr、Ni無機混合標準溶液(批號：15111)購自中國計量科學研究院，黃芪標準物質(zhì)GBW10028購自于國家質(zhì)量監(jiān)督檢疫。

 

實驗室測定用的6種活血止痛類中成藥均購自于藥店，分別為傷科接骨片、腰痛片、骨刺寧片、止痛化徵膠囊、骨折挫傷膠囊、腰痛寧膠囊。

 

2  、電感耦合等離子體質(zhì)譜法測定微量元素

 

2.1  樣品前處理

 

精密稱取樣品約0.5g，置聚四氟乙烯材料的微波消解罐中，加硝酸5mL，密閉并消解。消解采用程序升溫，20 ℃升溫至120℃，保持5 min；120 ℃升溫至150 ℃，保持5 min；150℃升溫至180 ℃，保持20 min。消解完全后，冷卻至低于60 ℃，取出消解罐，放冷，趕酸，將趕酸后的溶液轉(zhuǎn)移至50 mL的量瓶中，用少量超純水分次洗滌消解罐5次，合并至量瓶中，用水稀釋定容至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。同時制備空白溶液，除樣品外，其余同供試品溶液制備。

 

2.2  儀器測定條件

 

等離子體功率1550W，載氣為高純的氬氣；載氣流速1.0 L·min-1；采樣深度：5mm；冷卻氣流量：14L·min-1；輔助氣流量：0.8L·min-1；載氣流量：0.9 L·min-1；重復3次采集數(shù)據(jù)。

 

2.3  標準溶液的配制

 

精密量取無機混合標準溶液(批號：15111)適量，用2%的硝酸溶液稀釋，制成Na、Ca、Se、K、Cd、Pb、Al質(zhì)量濃度均分別為0.1、0.2、0.4、0.8、1.0 mg·L-1，含Mn、Fe、Zn、Cu、Ni、Ba、Mg、Cr、As質(zhì)量濃度均分別為0.2、0.4、0.8、1.0、2.0mg·L-1的系列混合標準溶液。

 

2.4  標準曲線和方法檢出限

 

取“2.3”項下系列混合標準溶液適量，按“2.2”項下條件進樣測定，以各元素的質(zhì)量濃度為橫坐標(X)、光譜響應值為縱坐標(Y)繪制各元素的標準曲線。Na、Ca、Se、K、Cd、Pb、Al、Mn、Fe、Zn、Cu、Ni、Ba、Mg、Cr、As、Pb等16種金屬元素檢測線性范圍為良好，r均≥0.999 5。取10個空白溶液測定空白強度值，按照空白值的3倍標準差計算檢出限(LOD)。結(jié)果見表1。

 

表1  各元素的線性關(guān)系考察結(jié)果

 

2.5  回收率及重復性試驗

 

分別精密稱取已知微量元素含量的骨折挫傷膠囊0.5g，各6份，加入一定量的混合標準溶液中，按“2.1”項下方法制備樣品溶液，制得加樣回收溶液，測定含量并計算回收率。結(jié)果，16種元素的平均回收率為91.6%～97.2%，因樣品中Na、Se、Cd含量低于檢測限，故方法重復性由回收率RSD表示，結(jié)果見表2。

 

2.6  精密度考察

 

取多元素混合標準溶液，按“2.1”和“2.2”項下試驗條件連續(xù)測定6次，計算精密度。結(jié)果各元素響應值的RSD均在0.31%～0.85%內(nèi)，說明該儀器精密度良好。

 

2.7  準確度考察

 

取適量的黃芪標準物質(zhì)GBW10028作為質(zhì)控樣品，按“2.1”項下的方法制備供試品溶液，再按“2.1”和“2.2”項下條件進樣測定，記錄響應值。根據(jù)質(zhì)控樣品測定結(jié)果顯示，16種元素的測定結(jié)果均在標準值范圍內(nèi)，表明本試驗所用儀器測定的準確度較好。

 

2.8  微量元素含量測定結(jié)果

 

稱取樣品各0.5 g，按“2.1”項下方法進行處理后，按“2.2”項下條件進行測定。結(jié)果見表3。

 

表2  加樣回收率結(jié)果

表3  各樣品中微量元素含量(n＝3)

 

由測定結(jié)果可以得出骨折挫傷膠囊中總砷的含量比較高，因此本文還對6種中成藥中砷形態(tài)進行了含量測定研究。

 

3、  砷形態(tài)測定

 

3.1  HPLC-ICP-MS測定條件

 

等離子體功率1550W，載氣為高純的氬氣；載氣流速1.0 L·min-1；采樣深度為5mm；冷卻氣流量為14L·min-1；輔助氣流量為0.8L·min-1；載氣流量為0.9 L·min-1；重復3次采集數(shù)據(jù)。采用AS7陰離子交換柱(4.0mm×250mm)，以10 mmol·L-1碳酸銨為流動相A，200mmol·L-1碳酸銨為流動相B，流速為1.0 mL·min-1，進樣體積為20 μL，梯度洗脫程序見表4，記錄離子流圖，見圖1，A是6種砷形態(tài)對照圖譜，B是骨折挫傷膠囊按“3.2”項下處理后進樣的圖譜。

表4  流動相梯度洗脫程序

A.6種形態(tài)砷標準溶液(The mixstandard solution of six kind of arsenic species)  B. 骨折挫傷膠囊樣品溶液(The samplesolution of Fracture Contusion Capsules) 1. AsB；  2. DMA；  3. As(Ⅲ)；  4. AsC；  5. MMA；  6. As(V)

圖1  離子流圖

 

3.2  樣品前處理

 

將樣品干燥后粉碎均勻，過20目藥篩，精密稱取樣品粉末0.25g，置于100 mL的具塞錐形瓶中，加入人工腸液20mL，超聲15min，放置過夜。次日放入90 ℃烘箱中提取3h，每隔0.5h振搖錐形瓶1min。提取完畢，吸取中層濾液10mL，用微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液5 mL，再用0.02mol·L-1的乙二胺四醋酸二鈉(EDTA)溶液稀釋至50mL量瓶中。將該溶液作為砷形態(tài)樣品測定，同時制備空白溶液。

 

3.3  線性及檢測限、定量限、線性范圍測定結(jié)果

 

用超純水逐級稀釋制備6個濃度梯度的混合標準溶液?；旌蠘藴嗜芤褐?，亞砷酸鹽的質(zhì)量濃度分別為0、1.04、2.08、4.16、8.33、16.7、20.82μg·L-1；砷酸鹽的質(zhì)量濃度分別為0、1.01、2.01、4.02、8.05、16.10、20.12μg·L-1；一甲基砷的質(zhì)量濃度分別為0、1.00、2.00、4.00、8.01、16.02、20.02μg·L-1；二甲基砷的質(zhì)量濃度分別為：0、1.00、2.01、4.02、8.03、16.06、20.08μg·L-1；砷甜菜堿的質(zhì)量濃度分別為：0、1.02、2.04、4.08、8.15、16.30、20.38μg·L-1；砷膽堿的質(zhì)量濃度分別為：0、1.00、2.01、4.02、8.04、16.08、20.10μg·L-1。取混合標準溶液逐級稀釋，稀釋至總離子流色譜圖中各形態(tài)色譜峰的信噪比(S/N) 下降約為3左右的濃度為該形態(tài)的檢出限(LOD)，各形態(tài)色譜峰的信噪比(S/N) 下降約為10左右的濃度為該形態(tài)的定量限(LOQ)。實驗得出6種砷形態(tài)的檢出限、定量限。

 

表5  6種砷形態(tài)的線性、檢出限、定量限及線性范圍

3.4  精密度

 

用骨折挫傷膠囊研究測定該方法的精密度、穩(wěn)定性和加標回收率。對該提取液連續(xù)進樣6 次，結(jié)果一甲基砷、二甲基砷、三價砷和砷膽堿這四種砷形態(tài)未檢出，計算得到砷甜菜堿、五價砷的RSD(n＝6)分別為1.01%和2.12%，均小于4%，結(jié)果表明該方法精密度良好。

 

3.5  重復性

 

精密稱取骨折挫傷膠囊6 份，按“2.1”項下方法制備供試品溶液，按“2.2”項下條件測定，計算6份供試品的含量結(jié)果的RSD值均<5%，符合砷形態(tài)分析要求。

表6  6種砷形態(tài)重復性測定結(jié)果(以As計)

 

3.6  穩(wěn)定性

 

選取一份4 ℃保存的供試品溶液分別于第0、2、4、8h內(nèi)測砷甜菜堿、五價砷的RSD(n＝4)，分別為0.97%和2.02%，其余砷形態(tài)均未檢出，表明該樣品在8h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

 

3.7  回收率

 

精密量取已知含量的骨折挫傷膠囊樣品0.5g，分別精密加入6種砷形態(tài)儲備液1、3、5mL，混勻后測定，每份樣品平行測定3份，回收率結(jié)果(表7)顯示：6種砷形態(tài)的回收率都在93.8%～98.7%之間。結(jié)果表明該方法回收率良好。

 

3.8  樣品測定結(jié)果

 

應用建立的方法對6種中成藥中的砷形態(tài)進行含量測定，每個樣品平行測定3次。結(jié)果見表8。

 

表7  6種砷形態(tài)的回收率實驗結(jié)果(以As計)

表8  樣品中6種形態(tài)分析結(jié)果(以As計，n＝6)

 

4、  討論與分析

 

4.1  測定方法的選擇

 

本文采用ICP-MS的方法測定了6種活血止痛類中成藥中的16種微量元素，并進行了方法學驗證，驗證結(jié)果良好，適合于中成藥中的元素含量測定，ICP-MS的方法具有可以同時測定多種元素的優(yōu)勢，并且靈敏度高。采用HPLC-ICP-MS對該類中成藥還進行了6種砷形態(tài)含量的研究，6種砷形態(tài)的分離度良好，峰型也良好，采用碳酸銨作為流動相的添加劑，對峰型的測定具有很好的調(diào)節(jié)作用，本次采用的ICP-QR型號的電感耦合等離子體質(zhì)譜儀，采樣錐孔比較小，流動相里的碳酸銨不會殘留在錐孔上，相比于《中國藥典》2015年版中采用磷酸二氫銨，可以有效避免儀器損傷。

 

4.2  砷形態(tài)測定供試品溶液的處理方法選擇

 

本文為了更好的反映活血止痛類中成藥進入人體后，其中可溶性砷被人體吸收的情況，因此模擬人體胃腸道環(huán)境，采用人工腸液提取，更好的反映了砷在人體環(huán)境中的溶出量。前期研究了該類活血止痛膠囊在水、人工胃液和人工腸液中無機砷的溶出總量，發(fā)現(xiàn)在水和人工胃液中沒有溶出量，因此本次處理提取溶液選擇了人工腸液，并對提取溫度、提取時間、提取方法進行了摸索，最后確定超聲提取15 min，放置過夜。次日放入90 ℃烘箱中提取3h，每隔0.5h振搖錐形瓶1min。由于該類藥物中無機砷含量比較低，采取了超聲提取，方法簡便，易操作，減少提取過程中砷含量的損失。

 

4.3  測定結(jié)果分析

 

從測定6種活血止痛類中成藥中16種微量元素測定結(jié)果可以得出：①各類活血止痛藥中的有益元素含量差別很大；其中有益元素Fe的含量以傷科接骨片和骨折挫傷膠囊含量最高，是因為處方中含有煅自然銅，樣品處理后會含有大量的Fe元素。Ca含量以止痛化徵膠囊、骨折挫傷膠囊含量最高，因為這兩類藥的處方中含有炙雞骨和豬骨，這兩味藥材中含有大量的Ca，有助于骨胳的生長。腰痛片和骨折挫傷膠囊中Mn元素也高于其它幾類藥品，錳主要存在于垂體、肝胰臟和骨的粒線體中，為多種酶的組成部分。②有害元素Cd在各樣品中均未檢出，骨折挫傷膠囊中有害元素Pb、As含量明顯高于其它藥品，可能是因為該藥的處方中含有大量豬骨，豬在飼養(yǎng)過程中可能因為有些飼料含有害重金屬元素，然后在豬骨富集。③其中微量元素Se均未檢出，傷科接骨片中重金屬Ni的含量高于別的品種，Ni本身沒有急性毒性，但是在體力合成羰基鎳就很容易中毒。

 

從砷形態(tài)測定結(jié)果可以得出：①骨折挫傷膠囊中的砷甜菜堿和砷膽堿含量最高，各為3.696 mg·kg-1和2.910mg·kg-1，五價砷含量為0.391mg·kg-1，但是砷甜菜堿和砷膽堿是無毒的砷形態(tài)，五價砷含有毒；②腰痛片中的砷形態(tài)測定結(jié)果：砷膽堿為0.476mg·kg-1、砷甜菜堿為3.205mg·kg-1，這兩種砷形態(tài)是無毒的，對人無太大傷害；③骨刺寧片和止痛化徵膠囊含有少量五價砷；傷科接骨片和腰痛寧膠囊中6種砷形態(tài)均未檢出；④該測定結(jié)果與“2.9”項下的總砷測定結(jié)果一致，可以知道總砷大部分來源于這6種砷形態(tài)的總和，根據(jù)該測定結(jié)果，可以更加明確地知道藥品中是含有有毒砷還是無毒砷。

 

雖然骨折挫傷膠囊中含有大量總砷，但是根據(jù)形態(tài)結(jié)果可以得出大部分砷為砷甜菜堿和砷膽堿，這兩種砷形態(tài)對人體無害。

 

4.4  展望

 

本文先對樣品進行微量元素測定，結(jié)果顯示除了總砷的含量高以外，還有鉻含量也很高，后期可以通過HPLC-ICP-MS對鉻形態(tài)進行更進一步研究，更加明確是何種鉻形態(tài)的含量高，更準確地控制中成藥的質(zhì)量。

 

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