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1、什么是基因毒性雜質(zhì)

基因毒性雜質(zhì)（或遺傳毒性雜質(zhì)，Genotoxic Impurity ，GTI）是指化合物本身直接或間接損傷細(xì)胞DNA，產(chǎn)生基因突變或體內(nèi)誘變，具有致癌可能或者傾向。潛在基因毒性的雜質(zhì)（Potential GenotoxicImpurity ，PGI）從結(jié)構(gòu)上看類似基因毒性雜質(zhì)，有警示性，但未經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明的黃曲霉素類、亞硝胺化合物、甲基磺酸酯等化合物均為常見的基因毒性雜質(zhì)，許多化療藥物也具有一定的基因毒性，它們的不良反應(yīng)是由化療藥物對正常細(xì)胞的基因毒性所致，如順鉑、卡鉑、氟尿嘧啶等。

 

2、 為何著重研究基因毒性雜質(zhì)

基因毒性物質(zhì)特點(diǎn)是在很低濃度時即可造成人體遺傳物質(zhì)的損傷，進(jìn)而導(dǎo)致基因突變并可能促使腫瘤發(fā)生。因其毒性較強(qiáng)，對用藥的安全性產(chǎn)生了強(qiáng)烈的威脅，近年來也越來越多的出現(xiàn)因?yàn)樵谝焉鲜兴幤分邪l(fā)現(xiàn)痕量的基因毒性雜質(zhì)殘留而發(fā)生大范圍的醫(yī)療事故，被FDA 強(qiáng)行召回的案例，給藥廠造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。例如某知名國際制藥巨頭在歐洲市場推出的HIV 蛋白酶抑制劑維拉賽特錠（Viracept， mesylate)，2007 年7 月，EMA 暫停了它在歐洲的所有市場活動，因?yàn)樵谄洚a(chǎn)品中發(fā)現(xiàn)甲基磺酸乙酯超標(biāo)，

 

甲基磺酸乙酯是一種經(jīng)典的基因毒性雜質(zhì)，該企業(yè)為此付出了巨大的代價，先內(nèi)部調(diào)查殘留超標(biāo)的原因，因在儀器設(shè)備清洗時乙醇未被完全清除而殘留下來，與甲基磺酸反應(yīng)形成甲基磺酸乙酯。在被要求解決污染問題后還被要求做毒性研究，以更好的評估對患者的風(fēng)險。同時有多達(dá)25000 名患者暴露于這個已知的遺傳毒性。直到解決了這所有問題后EMA 才恢復(fù)了它在歐洲的市場授權(quán)。近年來各國的法規(guī)機(jī)構(gòu)如ICH、FDA、EMA 等都對基因毒性雜質(zhì)有了更明確的要求，越來越多的藥企在新藥研發(fā)過程中就著重關(guān)注基因毒性雜質(zhì)的控制和檢測。

 

3、哪些化合物是基因毒性雜質(zhì)

雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)多種多樣，對于絕大多數(shù)的雜質(zhì)而言，往往沒有充分的毒性或致癌研究數(shù)據(jù)，因而難以對其進(jìn)行歸類。在缺乏安全性數(shù)據(jù)支持的情況下，這些法規(guī)和指導(dǎo)原則采用“警示結(jié)構(gòu)”作為區(qū)分普通雜質(zhì)和基因毒性雜質(zhì)的標(biāo)志。對于含有警示結(jié)構(gòu)的雜質(zhì)，應(yīng)當(dāng)進(jìn)行（Q）SAR 預(yù)測和體內(nèi)外遺傳毒性和致癌性研究，或者將雜質(zhì)水平控制在毒理學(xué)關(guān)注閾（TTC）之下。

 

目前，一般將致癌物分成兩大類：一類是遺傳毒性致癌物，通過化學(xué)鍵合直接破壞遺傳物質(zhì)產(chǎn)生致癌性，大多數(shù)的化學(xué)致癌物具有遺傳毒性；第二類是非遺傳毒性致癌物，通常不與發(fā)生化學(xué)鍵合作用不對產(chǎn)生直接破壞， 而是通過遺傳物質(zhì)外的間接機(jī)制引起致癌作用（ 如促進(jìn)細(xì)胞過度增殖等）。將多個文獻(xiàn)中的警示結(jié)構(gòu)匯總于（見原文PDF）。關(guān)于基因雜質(zhì)警示結(jié)果的具體詳細(xì)信息另外可參考?xì)W盟發(fā)布的警示結(jié)構(gòu)《Development of structure alerts for the in vivo micronucleus assay in rodents》?；蜻M(jìn)入The Carcinogenic Potency Database (CPDB)，里面有1547 種致癌物質(zhì)的列表，結(jié)構(gòu)式，CAS 號，作用部位，TTC 值等一系列信息。應(yīng)當(dāng)注意， 含有警示結(jié)構(gòu)并不意味著該雜質(zhì)一定具有遺傳毒性，而確認(rèn)有遺傳毒性的物質(zhì)也不一定會產(chǎn)生致癌作用。雜質(zhì)的理化性質(zhì)和其他結(jié)構(gòu)特點(diǎn)（如相對分子質(zhì)量、親水性、分子對稱性/ 空間位阻、反應(yīng)活性以及生物代謝速率等）會對其毒性產(chǎn)生抑制或調(diào)節(jié)作用。警示結(jié)構(gòu)的重要性在于它提示了可能存在的遺傳毒性和致癌性，為進(jìn)一步的雜質(zhì)安全性評價和控制策略的選擇指明方向。

 

4、 對基因毒性雜質(zhì)的法規(guī)要求及限度

最初，ICH 相繼推出的原料藥雜質(zhì)研究指導(dǎo)原則Q3A（R2）、制劑雜質(zhì)研究指導(dǎo)原則Q3B（R2），在這些指導(dǎo)原則中提及“對于能夠產(chǎn)生強(qiáng)的藥理活性或毒性的潛在雜質(zhì)，即使其含量低于0.1%，仍然建議進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定研究”。在之后的修訂版中，還進(jìn)一步明確“要關(guān)注原料藥中的潛在遺傳毒性雜質(zhì)”，以及“對于毒性非常強(qiáng)的雜質(zhì)，可能需要制定更低的限度”，但是其中并未明確闡述遺傳毒性雜質(zhì)的研究和控制問題，也未提出具體的研究原則、控制策略和限度要求。

 

在EMA（歐洲藥物評審組織）推出《遺傳毒性雜質(zhì)限度指導(dǎo)原則》, 引入了可接受風(fēng)險的攝入量，即毒性物質(zhì)限量，或稱毒理學(xué)關(guān)注門檻（TTC，Threshold of Toxicological Concern）這個概念。設(shè)置了限度值TTC(1.5 μg/day)，即相當(dāng)于每天攝入1.5 μg 的基因毒性雜質(zhì)，被認(rèn)為對于大多數(shù)藥品來說是可以接受的風(fēng)險（一生中致癌的風(fēng)險小于十萬分之一）。按照這個閾值，可以根據(jù)預(yù)期的每日攝入量計算出活性藥物中可接受的雜質(zhì)水平。需要指出的是TTC 是一個風(fēng)險管理工具，它采用的是概率的方法。假如有一個基因毒性雜質(zhì)，并且我們對它的毒性大小不太了解，如果它的每日攝入量低于TTC 值，那么它的致癌風(fēng)險將不會高于10-5 的概率，TTC 不能被理解為絕對無風(fēng)險的保障。在特定的條件下一些基因毒性雜質(zhì)也可以有較高的閾值。如接觸時間比較短等，這個需要根據(jù)實(shí)際情況再進(jìn)行推算。最近出臺的ICH M7《Assessment and Control of DNA Reactive (Mutagenic) Impurities inPharmaceuticals to Limit Potential Carcinogenic Risk》中較為詳盡的闡明了如何使用TTC 值，如何設(shè)定質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

 

下面就簡要介紹ICH M7 指導(dǎo)原則中的內(nèi)容。已經(jīng)建立的TTC 概念，用于界定所有未經(jīng)研究，但具有致癌風(fēng)險或其它毒性效果的化學(xué)品的可接受攝入量?；赥TC 的方法一般被認(rèn)為是非常保守的，因?yàn)樗鼈儬可娴綇慕o定的50%腫瘤發(fā)生率（TD50）簡單線性外推到十萬分之一發(fā)生率，且采用的數(shù)據(jù)是來自于最敏感物種和最敏感腫瘤部位的TD50 數(shù)據(jù)。在使用TTC 評估原料藥和制劑中誘變性雜質(zhì)的可接愛標(biāo)準(zhǔn)時，可以采用1.5 μg/天對應(yīng)于十萬分之一生命時長患癌風(fēng)險。但有些結(jié)構(gòu)基團(tuán)被識別為具有較高的效價，因此即使攝入量低于TTC 水平，從理論上來說仍會導(dǎo)致可能的顯著癌癥風(fēng)險。這類具有較高效價的基團(tuán)被稱為“關(guān)注隊列”，包括黃曲霉素類、N-亞硝基化合物，以及烷基-氧化偶氮基化合物。基于上述這些原因，應(yīng)進(jìn)行風(fēng)險評估來決定是否需要采取進(jìn)一步行動。根據(jù)誘變性和致癌性，可將雜質(zhì)分為五類，采用不同的控制措施，如下表。

應(yīng)采用（Q）SAR 方法進(jìn)行計算學(xué)毒性評估，預(yù)測細(xì)菌誘變含量的結(jié)果。要使用兩個相互補(bǔ)充的（Q）SAR 預(yù)測方法。一個方法應(yīng)是依據(jù)專家規(guī)則的，另一個方法則應(yīng)該是統(tǒng)計方式的。兩個互補(bǔ)的（Q）SAR 方法（專家規(guī)則和統(tǒng)計學(xué)）如果沒有發(fā)現(xiàn)結(jié)構(gòu)警示，則足以得出結(jié)論該雜質(zhì)沒有誘變可能，不需要做進(jìn)一步的檢測。

 

在對有關(guān)的警示結(jié)構(gòu)（第3 類）進(jìn)行確認(rèn)之后，可以采用充分的控制措施，或者對該雜質(zhì)單獨(dú)進(jìn)行細(xì)菌誘變測試。如果所得的細(xì)菌誘變測試結(jié)果為陰性，則可以推翻基于結(jié)構(gòu)的疑慮，這時不建議進(jìn)行進(jìn)一步的基因毒性評估。這些雜質(zhì)應(yīng)被當(dāng)作非誘變性雜質(zhì)（第5 類）。如果細(xì)菌誘變測試為陽性，則要進(jìn)行進(jìn)一步的危害性分析或采取控制措施（第2 類）。

 

如果一種雜質(zhì)具有與藥用物質(zhì)或相關(guān)化合物具有相似的警示結(jié)構(gòu)（例如，在相同位置和相同化學(xué)環(huán)境下具有相同警示結(jié)構(gòu)），且該物料的細(xì)菌誘變測試為陰性，則該雜質(zhì)可以被認(rèn)為是非誘變性的（第4類）。

 

根據(jù)TTC 計算可接受攝入量時，一個具有誘變性的雜質(zhì)每天每人攝入1.5 μg 時其風(fēng)險被認(rèn)為是可以忽略的（終生暴露情況下理論的患癌風(fēng)險小于十萬分之一），可以通用于大部分藥物，作為默認(rèn)的可接受限度控制標(biāo)準(zhǔn)。該方法一般用于長期治療用藥物中的誘變性雜質(zhì)（>10 年），且沒有致癌數(shù)據(jù)時（第2 類和3 類）。

因基因毒性雜質(zhì)毒性較大，須在工藝過程中對相關(guān)雜質(zhì)進(jìn)行控制。

 

在ICH M7 中也對工藝控制給出了方法。

(1)第一種方法

在原料藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中加入雜質(zhì)檢測并制訂質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，利于適當(dāng)?shù)膬x器分析方法。根據(jù)ICH Q6A，方法1 控制方式可以適用定期檢測。如果原料藥中的誘變性雜質(zhì)在至少6 個連續(xù)的中試批次或3 個連續(xù)的生產(chǎn)批次中，測得結(jié)果均低于可接受限度的30%，則可以論述進(jìn)行定期檢測。如果不滿足該條件，則建議對原料藥進(jìn)行常規(guī)檢測。

 

(2)第二種方法

在原料、起始物料或中間體的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中包括對雜質(zhì)的檢測，或作為中控檢測，同時制訂可接受標(biāo)準(zhǔn)，或采用適當(dāng)?shù)姆治龇椒?，將雜質(zhì)控制在可接受限度以下。

 

(3)第三種方法

在原料、起始物料或中間體的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中包括對雜質(zhì)的檢測，或作為中控檢測，同時制訂一個高于原料藥中可接受限度的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，采用適當(dāng)?shù)姆治龇椒?，配合?jīng)過證明雜質(zhì)致命知識，雜質(zhì)在后續(xù)工藝中被清除的知識，并對后續(xù)工藝進(jìn)行控制，保證原料藥中的該雜質(zhì)殘留水平低于可接受限度，而不需

要在后續(xù)工藝中再行檢測。當(dāng)實(shí)驗(yàn)室級試驗(yàn)（鼓勵采用加樣試驗(yàn)）數(shù)據(jù)，必要時可以采用中試生產(chǎn)或商業(yè)批次數(shù)據(jù)加以支持，顯示原料藥中雜質(zhì)水平低于可接受限度的30% 時，可以采用該方法。

 

(4)第四種方法

對工藝參數(shù)和殘留雜質(zhì)水平（包括致命性和清除知識）影響有了解，確信原料藥中的雜質(zhì)一定會低于可接受限度，此時，建議該雜質(zhì)不需要進(jìn)行分析測試（例如，不需要將雜質(zhì)列在任何質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中）。如果生產(chǎn)工藝的化學(xué)特性和工藝參數(shù)對誘變雜質(zhì)的影響水平是已知的，并且最終原料藥中雜質(zhì)殘留超出可接受限度的風(fēng)險已經(jīng)評估并認(rèn)為是可以忽略的，那么可以采用對工藝的控制來取代采用分析方法控制。

 

在很多情況下，只需要根據(jù)科學(xué)原理對該控制方法進(jìn)行論述就可以了?？茖W(xué)風(fēng)險評估要素可以用來論證第4 種方法?？梢愿鶕?jù)對雜質(zhì)去向和消除產(chǎn)生影響的理化特性和工藝因素，包括化學(xué)反應(yīng)性、溶解性、揮發(fā)性、離解性和所有用于去除雜質(zhì)的物理處理步驟進(jìn)行風(fēng)險評估。該風(fēng)險評估的結(jié)果可以用來作為雜質(zhì)被工藝所清除的預(yù)估因子。第4 種方法特別適用于那些本質(zhì)上來說就不穩(wěn)定的雜質(zhì)（例如亞硫酰氯與水迅速完全反應(yīng)），以及那些在合成路線早期引入，但已被有效清除的雜質(zhì)。有些情況下，如果已經(jīng)知道雜質(zhì)是在合成后期引入或形成的，則也可以采用第4 種方法，但這時，需要提交與工藝相關(guān)的數(shù)據(jù)來論述該方法的合理性。在ICH M7 中，除了給出這四種參考控制方法，還對具體用哪種方法，對哪些因素進(jìn)行考慮，以及上市申報CTD 需要提供哪些依據(jù)文件等，給出了一些具體說明，在此處不再累述。

5、如何檢測基因毒性雜質(zhì)

如前章所述，針對雜質(zhì)的不同毒性、服藥期長短等，設(shè)置不同的閾值，則需要相應(yīng)不同檢測手段，即開發(fā)擁有不同的檢測限的分析方法。

沃特世針對不同限度的基因毒性雜質(zhì)提供不同的解決方案，根據(jù)基因毒性雜質(zhì)限度的不同，可以分別使用UPLC/UV，2D UPLC/UV ，UPLC/QDa（單四極桿），UPLC/Xevo TQD（三重四極桿）。下面就分別介紹這幾種檢測手段的特點(diǎn)：

 

(1)UPLC/UV

相同的化合物，使用UPLC 代替HPLC，不僅檢測速度增加，靈敏度也會提升好幾倍，所以使用UPLC/UV 對常規(guī)限度較高的基因毒性雜質(zhì)都會有較好的效果。

 

如使用UPLC/UV 方法檢測苯磺酸氨氯地平樣品中的苯磺酸甲酯（MBS）和苯磺酸乙酯（EBS），在苯磺酸氨氯地平樣品中加標(biāo)15 ppm MBS 和EBS 六次進(jìn)樣的疊加譜圖?？煽闯?，對這一特定樣品，UPLC/UV 檢測即可達(dá)到FDA 和EMEA 對MBS 和EBS 的檢測水平要求。當(dāng)然，與UPLC 相連的檢測器也不局限于UV，根據(jù)化合物特性，如待檢測雜質(zhì)有熒光發(fā)色基團(tuán)，則可使用熒光檢測器與超高效液相連接，得到較好的靈敏度。

由HPLC 轉(zhuǎn)化成UPLC 方法，檢測速度和靈敏度都會大幅提升

加標(biāo)15 ppm 苯磺酸甲酯和苯磺酸乙酯的苯磺酸氨氯地平樣品的UV 分析

 

(2)2D UPLC/UV

2D UPLC 系統(tǒng)由兩個溶劑管理器、一個樣品管理器、一個色譜柱管理器和檢測器共同組成。它的應(yīng)用廣泛，在藥物領(lǐng)域中，最常用到的即為進(jìn)一步增加分離度、增加靈敏度的功能。

 

使用UPLC 二維技術(shù)，可以通過增大進(jìn)樣量的方式來提高靈敏度。使檢測限在UPLC/UV 的基礎(chǔ)上進(jìn)一步提升。

 

在一維體系中，大體積進(jìn)樣，并將目標(biāo)雜質(zhì)和API 有最基本的分離，然后將目標(biāo)雜質(zhì)（下圖中綠色部分）切入二維進(jìn)一步分離，得到無干擾的目標(biāo)雜質(zhì)峰，進(jìn)行定量更準(zhǔn)確。從下圖的定量檢測結(jié)果可看出，即使在5 ppm 的較低含量下，也有較好的回收率。

大體積進(jìn)樣提高靈敏度，將第一維中綠色部分切入到二維體系中

在二維中進(jìn)一步分離并定量

 

(3)UPLC/QDa（超高效液相色譜/QDa 單四極桿質(zhì)譜檢測器）

使用UPLC/UV 檢測器檢測基因毒性雜質(zhì)，雖然對目標(biāo)雜質(zhì)會有較好的響應(yīng)，但因其中API 的濃度很高，且API 中包含的其他雜質(zhì)很可能會對目標(biāo)的基因毒性雜質(zhì)產(chǎn)生干擾，即有些雜質(zhì)與目標(biāo)基因毒性雜質(zhì)有相同或?qū)⒔谋Ａ魰r間，易出現(xiàn)假陽性或回收率不好的現(xiàn)象。所以說UPLC/UV 的方法抗干擾能力及假陽性率會比較高。

 

而使用超高效液相與質(zhì)譜檢測器連接，就可以很好的解決此問題。使用質(zhì)譜檢測器不但能得到更好的靈敏度而且抗干擾能力更強(qiáng)。

 

Waters 研發(fā)的新型質(zhì)譜檢測器QDa，單四極桿、擁有一般質(zhì)譜的功能，可用于定性和定量；其體積小巧，與UV 檢測器大小相同；一鍵式開關(guān)，即開即用型，開機(jī)后儀器自動校準(zhǔn)，一刻鐘真空即可抽好；軟件參數(shù)設(shè)置簡單；成本低且維護(hù)成本也低；利于研發(fā)與QC 間方法轉(zhuǎn)移。

 

使用UPLC/UV 檢測苯磺酸氨氯地平樣品中加標(biāo)15ppm MBS 和EBS 六次進(jìn)樣的疊加譜圖。使用單四極質(zhì)譜檢測器檢測結(jié)果見下圖，其抗干擾能力大大增加。

加標(biāo)15 ppm 苯磺酸甲酯和苯磺酸乙酯的苯磺酸氨氯地平的MS 分析

(4)UPLC/Xevo TQD（超高效液相/三重四極桿質(zhì)譜儀）

當(dāng)追求更低的檢出限時，具體更高靈敏度的三重四極桿，常常是用戶的最佳選擇。Waters 有多種型號的三重四極桿可供用戶選擇，強(qiáng)大穩(wěn)定且久經(jīng)驗(yàn)證的Xevo TQD、有進(jìn)一步提高靈敏度和耐用性的Xevo TQ-S micro、還有邁向極致靈敏度的Xevo TQ-S。一般情況下，使用Xevo TQD 三重四極桿就可以完全滿足基因毒性雜質(zhì)的檢測限要求。采用Xevo TQD 質(zhì)譜儀檢測甲磺酸，可輕松測定至0.1 ng/mL的濃度。

 

三重四極桿可通過多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）模式借助MS/MS 功能來實(shí)現(xiàn)極致的定量，如達(dá)到ppb 級別，甚至是ppt 級別。并且軟件有自動開發(fā)功能，自動查找最佳的MS/MS 離子對和碰撞電壓。通過軟件的定量工作流程使整個分析從頭到為都是最簡化最快速。

 

同時可使用“RADAR”功能，查看基質(zhì)對雜質(zhì)檢測的干擾情況，使用戶能夠全面了解情況，進(jìn)而更快速更有信心的開發(fā)方法。借助子離子確認(rèn)掃描（PICs）這一功能，用戶在做定量檢測的同時，可通過PICs 自動觸發(fā)子離子掃描，得到其二級碎片譜圖，用于對目標(biāo)化合物的進(jìn)一步確證

使用UPLC/Xevo TQD 檢測0.1 ng/mL 的甲磺酸

 

(5)UPLC/QTof（超高效液相/ 飛行時間質(zhì)譜）

隨著對雜質(zhì)定性方面的要求更多，越來越多的用戶也會考慮使用飛行時間質(zhì)譜對基因毒性雜質(zhì)進(jìn)行檢測。

 

沃特世飛行時間質(zhì)譜Xevo G2-XS QTof 能夠得到最準(zhǔn)確的分子式及二級碎片譜圖，為雜質(zhì)的定性提供最全面的信息。并且也具有MRM 功能，可以在基質(zhì)中得到最優(yōu)化的靈敏度，實(shí)現(xiàn)進(jìn)一步的定量測定。其軟件功能強(qiáng)大且界面直觀友好，方便建立數(shù)據(jù)庫，用戶可通過軟件對常見的基因毒性雜質(zhì)建立數(shù)據(jù)庫，然后再通過此數(shù)據(jù)庫對不同批次不同產(chǎn)品進(jìn)行基因毒性雜質(zhì)的篩查。對基因毒性雜質(zhì)防范于未然。