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介孔二氧化硅薄膜已逐漸被用于生物涂層設(shè)計(jì)。本研究采用油水兩相法，在鈦納米管表面均勻生長出垂直向介孔二氧化硅薄膜（VMSTF）。所構(gòu)成的大孔-介孔梯度形貌，使鈦表面的物理結(jié)構(gòu)和化學(xué)成分與骨組織更加接近。研究發(fā)現(xiàn)該涂層兼具降解快、可載藥、促成骨的功效。這是VMSTF作為骨種植體涂層的首次探索，為相關(guān)研究提供了借鑒。

01、研究內(nèi)容簡介

牙種植修復(fù)技術(shù)已廣泛地應(yīng)用于恢復(fù)患者牙列缺損或缺失，成為一種常規(guī)的修復(fù)方法，但更快更好的骨結(jié)合仍是目前臨床種植技術(shù)需解決的關(guān)鍵問題。種植體表面處理是影響骨結(jié)合的一個重要因素，也是目前國內(nèi)外研究熱點(diǎn)。課題組前期在鈦表面采用酸蝕和陽極氧化技術(shù)制備的微米/納米管結(jié)構(gòu)，因其類似骨組織結(jié)構(gòu)的仿生設(shè)計(jì)而表現(xiàn)出優(yōu)異的促成骨功能。然而，進(jìn)一步在納米結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上進(jìn)行介孔結(jié)構(gòu)修飾或?qū)?shí)現(xiàn)更理想的骨仿生效果，值得探索。介孔硅納米薄膜因其極高的比表面積、易于修飾的內(nèi)外表面，無毒可降解等特點(diǎn)受到了越來越多的關(guān)注。然而在鈦種植體表面制備垂直向介孔硅納米薄膜尚未見文獻(xiàn)報道。傳統(tǒng)的蒸發(fā)誘導(dǎo)自組裝法制備的薄膜始終存在兩大局限：（1）由于硅膠束有水平排列的自發(fā)趨勢，該薄膜內(nèi)部孔道多為水平走行（Parallel aligned mesoporous silica thin film, PMSTF），導(dǎo)致薄膜與外界的滲透性差。（2）目前鈦基底表面往往會預(yù)先進(jìn)行微納米形貌加工，但這類薄膜厚度較厚，通常會覆蓋整個基底表面，可能會阻礙這些活性形貌作用的發(fā)揮(Fig. 1a)?；诖?，本研究創(chuàng)新性地在鈦納米多孔結(jié)構(gòu)表面，采用油水兩相法成功制備出垂直向介孔二氧化硅薄膜（Vertical aligned mesoporous silica thin film, VMSTF）（Fig. 1b）。該薄膜不僅具有直通外界的介孔孔洞（~3 nm），而且可沿納米管（TNT）表面均勻、連續(xù)沉積，構(gòu)成了復(fù)合梯度納米結(jié)構(gòu)。在此基礎(chǔ)上本研究系統(tǒng)觀察和討論了VMSTF@TNT的降解行為、載藥能力和成骨活性（Fig. 1c）。

Fig. 1 The structure comparison between conventional PMSTF (a) and VMSTF (b). The main steps for the preparation of VMSTF@TNT(c).

研究首先采用陽極氧化法，在純鈦表面構(gòu)筑了大孔級TNT陣列結(jié)構(gòu)（管徑約100 nm）。TNT是已被廣泛研究的，具有內(nèi)在骨誘導(dǎo)活性的經(jīng)典形貌結(jié)構(gòu)。在此結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上采用油水兩相法，在納米管表面制備垂直向介孔硅薄膜（VMSTF）。通過透射電鏡觀察，可見VMSTF與TNT緊密交聯(lián)，并沿管壁四周均勻沉積，厚度約20 nm。VMSTF沉積過程較為緩和且可控。在2 h時TNT表面首次出現(xiàn)介孔結(jié)構(gòu)，此后VMSTF主要在管內(nèi)沉積，直至24 h后徹底填滿管腔而轉(zhuǎn)變?yōu)楣芡獬练e（Fig. 2）。

Fig. 2 FE-TEM (a, b), STEM (inset) and growing process observations (c) of  VMSTF on TNT.

研究者接著在模擬生理環(huán)境下（PBS，37℃），觀察到了VMSTF的高速降解性。結(jié)果顯示：介孔形貌2 h后基本消失，24 h后薄膜基本降解完全，最終硅離子釋放總量約為10 ppm（Fig. 3）。VMSTF所表現(xiàn)的小時尺度內(nèi)的降解速率以及稀少的硅釋放總量，為其生物安全性奠定了基礎(chǔ)。

Fig 3. ICP-AES analysis of the released silicon ion (a) and the FE-SEM observations of VMSTF@TNT after incubation with PBS for 72 h (b). White scale bar=200 nm, yellow scale bar=50 nm.

為了驗(yàn)證VMSTF的載藥能力，本研究采用地塞米松（DEX）作為模型分子進(jìn)行了藥物加載/釋放效率實(shí)驗(yàn)。FE-SEM及ATR-FTIR光譜結(jié)果證實(shí)了TNT，PMSTF，VMSTF@TNT表面均成功負(fù)載DEX。但VMSTF的負(fù)載量是其余兩組的2.3倍。此外，VMSTF表面藥物雖釋放稍緩，但釋放率未見明顯差異。因此，VMSTF較單純的納米管或傳統(tǒng)的水平介孔硅具有更出色的載藥性能，但若要實(shí)現(xiàn)更理想的緩釋或控釋效果可能需要進(jìn)一步修飾（Fig. 4）。

Fig 4. Drug delivery from different surfaces. (a) DEX loading observation by FE-SEM. White scale bar=200 nm, yellow scale bar=50 nm. (b) ATR-FTIR spectrum of DEX loaded samples and (c, d) their DEX loading/release behaviors. *p< 0.05, **p< 0.01 (vs VMSTF@TNT).

植入物表面的親水性與成骨細(xì)胞的早期生物學(xué)行為密切相關(guān)。VMSTF@TNT表面展現(xiàn)出較強(qiáng)的親水性（Fig. 5a），這可能由于介孔孔洞表面所帶的大量硅羥基引起。為了進(jìn)一步驗(yàn)證VMSTF@TNT的體外生物學(xué)效果。本研究采用MC3T3-E1細(xì)胞進(jìn)行了一系列體外評價。結(jié)果表明：VMSTF@TNT表面細(xì)胞早期粘附數(shù)量、細(xì)胞活力，成骨分化能力均顯著增強(qiáng)（Fig. 5b-j）。這些結(jié)果證實(shí)，VMSTF可以在成骨細(xì)胞功能的多個階段發(fā)揮積極作用。

Fig 5. Hydrophilicity, cell behaviors and osteogenic differentiation on the surface of three samples. (a) Water contact angle measurements. (b, c) CLSM images showing the attachment and morphology of MC3T3-E1. White scale bar=200 nm, yellow scale bar=50 nm, blue bar=5 μm. (d) Quantification of attached cell counts. (e) Cell viability of MC3T3-E1 as measured by CCK-8. (f) Relative mRNA expression of four osteogenic genes. (g, h) The ALP activity staining and quantification. (i, j) The calcium nodules formation evaluation by Alizarin Red staining and semi-quantification. *p< 0.05, **p< 0.01, ***p< 0.001.

總結(jié)：通過油水兩相法制備的垂直向介孔硅薄膜，使鈦表面在大孔級納米管結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上進(jìn)一步形成了介孔級結(jié)構(gòu)和硅元素的負(fù)載，這與骨組織結(jié)構(gòu)和成分更加接近。該結(jié)構(gòu)中，介孔通道與外環(huán)境之間的有效溝通可帶來三個主要的突出優(yōu)勢：1. 降解速度快，可以使效應(yīng)細(xì)胞及時與鈦基底接觸，充分發(fā)揮基底納米管結(jié)構(gòu)的促成骨優(yōu)勢；2. 具備藥物裝載/釋放能力，可用于治療；3. 通過介孔結(jié)構(gòu)與硅元素的釋放可促進(jìn)成骨細(xì)胞粘附和分化，進(jìn)一步增強(qiáng)納米管的成骨能力。這項(xiàng)工作為生物材料表面涂層設(shè)計(jì)提供了新的研發(fā)策略，顯示了介孔材料在組織工程中的廣闊應(yīng)用前景。

該研究得到了國家自然科學(xué)基金（81530051/   31800790/ 31670966）、陜西省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目(2019SF-031)、丹麥Frie   Forskningsfond 基金(9040-00219B)等項(xiàng)目支持。

原文信息

Zhe Li, Yide He, Lasse Hyldgaard Klausen, Ning Yan, Jing Liu, Fanghao Chen,Wen Song*, Mingdong Dong*, Yumei Zhang*.   

Growing vertical aligned mesoporous silica thin film on nanoporous substrate for enhanced degradation, drug delivery and bioactivity. 

Bioactive Materials 6 (2021) 1452–1463.