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今日，國家藥監(jiān)局批準(zhǔn)發(fā)布了《通宣理肺丸（水蜜丸）、九味羌活丸（水丸）中水稻源性成分檢查項補充檢驗方法（BJY 202013）》。

通宣理肺丸（水蜜丸）、九味羌活丸（水丸）中水稻源性成分檢查項補充檢驗方法

（BJY 202013）

【檢查】水稻源性成分

樣品制備供試樣品制備取通宣理肺丸（水蜜丸）或九味羌活丸（水丸）適量，粉碎，稱取10 g，加入65℃預(yù)熱的TE緩沖溶液（pH 8.0）（10mmol/L Tris-HCl，1mmol/L EDTA）50ml，65℃水浴振搖至完全分散，立即吸取0.5mL混懸液至2mL離心管中，即得。

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)樣品制備取水稻源性DNA檢測標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)1支，加無菌超純水100μl溶解，即得。

空白對照樣品制備取0.5mL的無菌TE緩沖溶液至2 mL離心管中，即得。

模板DNA提取  取上述樣品，選用植物基因組DNA提取試劑盒（離心柱型）提取，得模板DNA溶液，儲存于-20℃?zhèn)溆谩?/span>

PCR反應(yīng)  鑒別引物：5' TTAGCCTCCCGCTGCAGA3'和5' AGAGTCCACAAGTGCTCCCG3'。PCR反應(yīng)體系：在200μl離心管中進行，反應(yīng)總體積為25μl，反應(yīng)體系：2×PCR預(yù)混液（包含DNA聚合酶、dNTPs、MgCl2、反應(yīng)緩沖液等）12.5μl，鑒別引物（50μmol/L）各0.2μl，模板DNA溶液（或水稻源性DNA檢測標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)）2μl，無菌超純水10.1μl。每個樣品設(shè)置2個平行。PCR反應(yīng)參數(shù)：95℃預(yù)變性3分鐘，循環(huán)反應(yīng)40次（95℃30秒，62℃30秒，72℃30秒），72℃延伸10分鐘，4℃保存反應(yīng)產(chǎn)物。

電泳檢測  照瓊脂糖凝膠電泳法（《中國藥典》2015年版四部通則0541），膠濃度為2.0%，膠中加入核酸凝膠染色劑GelRed；供試品、水稻源性DNA檢測標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和空白對照溶液的上樣量分別為10-20μl，DNA分子量標(biāo)記物（建議使用DL500）上樣量為5μl。電泳結(jié)束后，取凝膠片在凝膠成像儀上檢視。

系統(tǒng)適用性  （1）空白對照在凝膠電泳圖譜中應(yīng)無條帶檢出；（2）水稻源性DNA檢測標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在凝膠電泳圖譜50~100bp中應(yīng)有條帶檢出。應(yīng)同時滿足以上2個條件，否則實驗無效。

克隆測序  使用商業(yè)化PCR產(chǎn)物克隆試劑盒，將PCR特征條帶克隆到T載體上，用Sanger法進行序列測定，與水稻參考序列進行比對分析。

結(jié)果判定  凝膠電泳圖譜中，供試品在50~100bp間不得出現(xiàn)與水稻源性DNA檢測標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)大小一致的條帶。若出現(xiàn)相應(yīng)的條帶，其克隆測序結(jié)果與給定水稻參考序列應(yīng)不一致。若出現(xiàn)個別堿基差異，將克隆測序結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫中其他水稻序列進行比對，不應(yīng)100%匹配。

水稻參考序列：AGAGTCCACAAGTGCTCCCGCGCGTCCGAAGAAACCAACCACACTGCCGCTCTGCAGCGGGAGGCTAA。

備注：本方法所用容器應(yīng)為一次性耗材或經(jīng)過徹底清洗和高壓消毒并消除核酸污染的耗材，否則不可重復(fù)使用。試劑均為分析純或生化試劑，實驗用水應(yīng)符合GB/T6682的要求。所有試劑均用無DNA酶污染的容器盛裝。