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從穩(wěn)定性角度揭示離子摻雜對磷酸鈣材料的影響機制將有力推動摻雜改性策略的發(fā)展。本研究以生物磷灰石前驅(qū)相磷酸八鈣作為模型，發(fā)現(xiàn)不同電荷和半徑的離子摻雜會在不同程度和相反方向上改變材料的熱穩(wěn)定性，并通過介導材料的表面特性和離子釋放協(xié)同調(diào)控其成骨活性。本研究為理解離子摻雜改性機制和開發(fā)生物活性磷酸鈣材料提供參考依據(jù)。

01、研究內(nèi)容簡介

開放性骨折或種植手術(shù)后的骨感染仍然是骨科領域的一個挑戰(zhàn)。由可生物降解聚合物制成的3D添加劑制造(AM)支架是支持在骨不連情況下骨愈合的理想材料，并可通過加入抗生素賦予其抗菌性能。在本研究中，環(huán)丙沙星和慶大霉素分別插層在鎂鋁水滑石和α-磷酸鋯層間。結(jié)果表明，通過高溫熔融擠壓來構(gòu)建用于骨再生和預防感染的雙功能3D支架是可能的。

圖1熔融擠出法制備的抗菌復合支架(PEOT/PBT-填料-抗生素)示意圖。這些聚合物復合材料支架包含MgAl插層復合材料或ZrP插層復合材料。當浸沒在洗脫液溶液中時，陰離子可以與CFX交換，CFX從填料和聚合物基質(zhì)中擴散到洗脫液中。另一方面，陽離子可以在基于ZrP的GTM系統(tǒng)中與GTM交換，允許GTM從填料和聚合物基質(zhì)中擴散出來?？股氐尼尫刨x予支架抗菌活性。

圖2復合支架的填料分布和抗生素定位。支架橫截面和細絲表面的BSEM顯微照片，描繪了不同填料-抗生素濃度下(A) MgAl-CFX_s和(B) ZrP-GTM_s上的填料分布(如白點)。比例尺250 μm。(C) 20%MgAl-CFX_s和(D) 20% ZrP-GTM_s的代表性纖維橫截面的EDAX元素圖。比例尺50 μm。

如圖2所示，背散射電子顯微鏡(BSEM)圖像證實，隨著支架細絲表面和橫截面上填充物抗生素濃度的增加，填充物(可見為亮點)的數(shù)量也在增加。用能量色散X射線能譜(EDS)分析了填料為含MgAl和ZrP的顆粒，發(fā)現(xiàn)CFX(F和N)和GTM(S和N)分子中獨特的原子元素與它們各自的片狀顆粒共存(圖2C和D)。這有力地表明，經(jīng)過熔融共混和AM處理后，纖維中的填料和抗生素沒有分離，而是保持了原有的填料結(jié)構(gòu)。此外，在加工步驟中，兩種類型的填料的顆粒大小都保持在合成后的值內(nèi)。在AM過程中觀察到了輕微的尺寸減小，可能是由于打印頭螺釘中較高的剪切力(圖1)。盡管在纖維表面附近存在一些填充聚集體，但復合支架的表面粗糙度在微觀上沒有明顯變化，表面光滑，可與PEOT/PBT支架媲美(圖2)。地下集合體確實形成了地形投影，但由于其數(shù)量較少且間隔較大(約為100μm)，細胞不太可能同時與多個投影相互作用。

為了評價MgAl-CFX_s和ZrP-GTM_s的抗生素釋放動力學，將復合支架與dPBS孵育，并隨時間監(jiān)測CFX和GTM的釋放量。如圖3A所示，通過增加MgAl-CFX_s中的MgAl-CFX濃度，隨著時間的推移，釋放出更多的CFX。在ZrP-GTM_s的GTM釋放曲線上也觀察到了類似的趨勢(圖3B)。這一趨勢表明，通過調(diào)整與聚合物基質(zhì)混合的填充物-抗生素濃度，可以設計一種定制的支架，隨著時間的推移釋放所需數(shù)量的抗生素。雖然兩種體系均表現(xiàn)出填充劑-抗生素濃度依賴的釋放曲線，但在MgAl-CFX_s和ZrP-GTM_s上觀察到顯著不同的釋放動力學。在所評價的時間內(nèi)(1個月)，CFX從MgAl-CFX_s中持續(xù)釋放，而從ZrP-GTM_s中的GTM在最初的24小時內(nèi)突然釋放，隨后緩慢釋放，直到研究結(jié)束(圖3A和B)。

為進一步了解20%ZrP-GTM_s的釋藥機理，將釋藥過程分為兩個階段：快速釋藥階段I(<24小時)和緩釋階段II(>24小時)。修正的Freundlich動力學模型，描述了粘土通過離子交換從平面上的非均勻擴散，被發(fā)現(xiàn)解釋了第一階段的釋放(圖2)。這意味著GTM在最初的24小時內(nèi)通過陰離子交換快速擴散到介質(zhì)溶液中，這是由于抗生素在水基中性pH洗脫液中的高溶解性[48-50]。由于在研究期過后，GTM的釋放量沒有達到100%(圖3)，假設第一階段釋放的GTM來自位于支架纖維表面的ZrP顆粒，之后聚合物網(wǎng)絡阻止了內(nèi)部ZrP顆粒的GTM釋放，導致第二階段觀察到的平臺狀輪廓(圖3B)。這種行為已經(jīng)被報道過，可能是由于PEOT/PBT在特定PEO相對分子質(zhì)量(300 KDa)和PEOT/PBT鏈段比(55：45)下較差的吸水/溶脹能力(4%吸水率)，水分子在聚合物網(wǎng)絡中的擴散速率較低。在這種情況下，仍然并入體系中的GTM可以在聚合物降解時釋放，這一過程可以通過增加共聚物的PEO鏈段的分子量或使用不同的更快的降解材料來加速。根據(jù)同樣的推論，MgAl-CFX_s的CFX釋放曲線沒有達到平臺期，只有大約15%-20%的CFX被釋放(圖2)，表明評價期間釋放的CFX也來源于纖維表面的MgAl顆粒。這可能是由于CFX在中性pH下的低溶解度，以及可能是較強的填料-抗生素相互作用，20%的ZrP-GTM_s在20%的MgAl-CFX_s中沒有出現(xiàn)第一階段的快速釋放。

圖3 不同洗脫條件下MgAl-CFX和ZrP-GTM共聚物復合材料的抗生素釋放曲線。在37℃的4周時間內(nèi)，鎂鋁復合材料中的(A) CFX和ZrP復合材料中的(B) GTM在dPBS中的累積釋放證明了填料-抗生素濃度依賴性釋放。填料的存在和洗脫液的酸堿度對(C) CFX和(D) GTM從填料-抗生素復合膜(分別為20%MgAl-CFX_f和20% ZrP-GTM_f)和由相當量的抗生素直接分散在共聚物基質(zhì)(10% CFX_f和10% GTM_f)中組成的膜中的累積釋放百分比的影響，在37℃下，在酸性、中性和堿性的緩沖液中浸泡3周。

為了更深入地了解MgAl-CFX_s和ZrP-GTM_s促進新骨形成的潛能，對種植在不同支架上的hMSCs的成骨分化能力進行了分析。初步結(jié)果表明，填充物-抗生素復合體的存在對hMSCs的成骨能力有影響。在礦化介質(zhì)(MM)中28天后，所有濃度的MgAl-CFX_s和20%的ZrP-GTM_s上都沒有觀察到或定量地觀察到礦物沉積，而在5%和10%的ZrP-GTM_s中，鈣沉積比對照樣品減少了約10倍(圖3)。然而，僅使用聚合物和填充劑的對照支架在MM中28天后觀察到鈣沉積，達到先前研究報告的水平。這表明填充物不影響hMSCs的成骨行為。

為了預防植入物相關手術(shù)骨折后的感染，需要局部應用抗生素。本研究的目的是開發(fā)高溫熔融擠出AM法制備的抗生素負載型三維支架。為了保護抗生素在制備過程中不受熱應力的影響并獲得緩釋，將抗生素CFX和GTM分別插入到無機層狀填料MgAl和ZrP的片層結(jié)構(gòu)中，然后再分散到聚合物基質(zhì)中。與無填料體系相比，填充基支架具有更好的緩釋效果?？股赝ㄟ^通過聚合物基質(zhì)的擴散和由離子交換或pH變化控制的機制釋放。對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌顯示出與未經(jīng)加工的抗生素相同的抗菌水平，證實了高溫AM后抗生素的功能性。重要的是，在支架中加入填充物和抗生素既不會影響hMSCs的活性，也不會阻止其成骨分化，正如基質(zhì)礦化、大腸桿菌和OPN的表達所證實的那樣。這些新提出的方法可以通過在高溫下制備的支架中直接加入抗生素來制造雙功能支架，并有可能改善感染管理，同時允許骨再生。此外，這種方法為未來使用其他相關抗生素和可生物降解的熱塑性聚合物的研究打開了大門，以進一步優(yōu)化該系統(tǒng)，使其走向臨床應用。

原文信息

M. Cámara-Torres, S. Duarte, R. Sinha, A. Egizabal, N. Álvarez, M. Bastianini, M. Sisani, P. Scopece, M. Scatto, A. Bonetto, A. Marcomini, A. Sanchez, A. Patelli, C. Mota, L. Moroni, 

3D additive manufactured composite scaffolds with antibiotic-loaded lamellar fillers for bone infection prevention and tissue regeneration, 

Bioactive Materials 6(4) (2021) 1073-1082. 

Doi:10.1016/j.bioactmat.2020.09.031