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什么是內(nèi)毒素？

內(nèi)毒素是包在革蘭氏陰性細(xì)菌外膜中的脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）。它們代表了制藥和醫(yī)療設(shè)備企業(yè)而言最重要的熱原。內(nèi)毒素之所以重要，是因?yàn)樗鼈冊(cè)诃h(huán)境中無(wú)處不在，熱穩(wěn)定好且不可以過(guò)濾去除。重要的是，它們極易熱解。內(nèi)毒素刺激單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞分泌一系列炎癥細(xì)胞因子，包括腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor，TNFα）、白介素（IL）-1族、IL-6、IL-8、IL-10族、IL-12族、IL-15族和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（transforming growth factor-β，TGFβ）。

通常，LPS具有三個(gè)結(jié)構(gòu)組件。脂質(zhì)A、LPS疏水部分、親水性雜多糖核心區(qū)域和O型特異性寡糖區(qū)域，他們?cè)谘逍椭幸蚓甓?。核心區(qū)域的第一個(gè)糖（3-脫氧-D-甘露糖辛酸或KDO）連接到6'位置，并將核心多糖連接到脂質(zhì)A。LPS的所有生物活性都存在于脂質(zhì)中一個(gè)區(qū)域。

脂質(zhì)A具有一個(gè)在位置1'和4'處帶有磷?；?beta;二葡萄糖胺主鏈。對(duì)于大腸桿菌和革蘭氏陰性細(xì)菌腸桿菌科的其他成員，此主鏈在2、3、2'和3'位置被β-羥基肉豆蔻酸酯?；?。仲?；謩e在2'和3'位置被月桂酸酯和肉豆蔻酸酯化。這里描述的脂質(zhì)A結(jié)構(gòu)是經(jīng)典結(jié)構(gòu)，并且是天然免疫應(yīng)答最強(qiáng)大的激活劑之一。

并非所有革蘭氏陰性生物都產(chǎn)生激活先天免疫應(yīng)答的脂質(zhì)A結(jié)構(gòu)?；罨Q于磷酰基的存在，?；湹臄?shù)量和?；湹拈L(zhǎng)度。來(lái)自幽門(mén)螺桿菌，鼠疫耶爾森氏菌和土拉弗朗西斯菌的LPS具有致病性，但是它們的LPS結(jié)構(gòu)很難被Toll樣受體（TLR4）識(shí)別，因此可以逃避宿主檢測(cè)。即使在腸桿菌科家族中，經(jīng)典的LPS體系結(jié)構(gòu)也會(huì)發(fā)生變化。在低鎂和低pH的條件下，發(fā)生棕櫚酸酯添加和糖脂A磷酸基團(tuán)與陽(yáng)離子糖或磷酸乙醇胺的修飾。在高鐵、鋁和鈣的環(huán)境中也會(huì)發(fā)生改性。來(lái)自所有革蘭氏陰性細(xì)菌的LPS不斷進(jìn)行修飾或重塑。脂質(zhì)A的重塑取決于環(huán)境條件，并主要通過(guò)PhoP-PhoQ和PmrA-PmrB兩組分調(diào)節(jié)系統(tǒng)進(jìn)行控制。

革蘭氏陰性細(xì)菌的外膜高度不對(duì)稱(chēng)，內(nèi)部小葉中含有甘油磷脂，而暴露于細(xì)胞表面的LPS則含有LPS。它用作滲透屏障。大多數(shù)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)通過(guò)稱(chēng)為孔蛋白的外膜蛋白（OMP）家族穿過(guò)此屏障。外膜的變化會(huì)影響其完整性、流動(dòng)性和滲透性。LPS和外膜成分的重塑代表了一種協(xié)調(diào)的生存方式。外膜囊泡（OMV）具有革蘭氏陰性細(xì)菌分泌過(guò)程，可促進(jìn)外膜的重塑。

外膜囊泡是由革蘭氏陰性細(xì)菌普遍產(chǎn)生的納米顆粒。它們的直徑范圍為20–250nm，并且包含不再需要的或?qū)ι嬗泻Φ牡鞍踪|(zhì)、脂質(zhì)、LPS和其他生物活性物質(zhì)。它們通常具有與精心制作OMV的細(xì)菌外膜相似的成分。OMV產(chǎn)生是細(xì)菌的應(yīng)激反應(yīng)，對(duì)于養(yǎng)分獲取、生物膜發(fā)育、水平遺傳交換以及復(fù)雜微生物群落中發(fā)生的其他種間相互作用具有重要作用。這些區(qū)經(jīng)常處于溫度和營(yíng)養(yǎng)壓力之下。這些微生物群落的內(nèi)毒素?zé)o法在實(shí)驗(yàn)室中產(chǎn)生，因?yàn)榇嬖诩竟?jié)性和其他本地因素，這些因素賦予了當(dāng)?shù)靥厣＿@些微生物種群存在于所有制藥操作中。

過(guò)去

1912年，Hort和Penfold開(kāi)發(fā)并完善了一種兔子動(dòng)物模型，該模型促進(jìn)了注射熱的研究。他們對(duì)兔子模型精心控制了品種、性別、體重、食物和環(huán)境飼養(yǎng)條件。在每個(gè)實(shí)驗(yàn)中都報(bào)告了劑量。間隔30分鐘進(jìn)行溫度測(cè)量。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)使他們能夠最終證明，當(dāng)使用新鮮蒸餾水進(jìn)行靜脈注射時(shí)，不存在發(fā)燒體（FPB）。Hort和Penfold取消了與以下各項(xiàng)有關(guān)的所有理論：（a）水熱，（b）鹽熱，（c）碳水化合物熱，（d）發(fā)酵熱和（e）組織熱。不幸的是，直到1923年，他們的工作才得到適當(dāng)?shù)恼J(rèn)可。

1923年，F(xiàn)lorence Seibert認(rèn)可了Hort和Penfold進(jìn)行科學(xué)研究的基本價(jià)值。她對(duì)注射熱的研究使用了他們開(kāi)發(fā)的相同的兔子模型。Seibert成功地確認(rèn)并擴(kuò)展了前提條件，即蒸餾水中的熱源材料是細(xì)菌來(lái)源的，并且這些材料不會(huì)通過(guò)過(guò)濾除去。最重要的是，她介紹了“一種制備非熱源水的方法”。她的制備非熱原性蒸餾水的方法包括用堿將連接塞子加熱幾次（去熱原），并在蒸餾瓶上方引入一個(gè)“收集器”。捕集并防止熱原被機(jī)械地帶入餾出物中。

隨著1930年代整個(gè)腸胃外產(chǎn)業(yè)的興起以及二戰(zhàn)之前和二戰(zhàn)期間對(duì)腸胃外解決方案的大量需求，確保商業(yè)腸胃外解決方案不受熱原污染的需求觸發(fā)了美國(guó)藥典（USP）的發(fā)展，熱原體藥典測(cè)試應(yīng)運(yùn)而生。1941年，USP、NIH、FDA和14家制藥公司合作開(kāi)展了熱原測(cè)試的第一項(xiàng)研究。該研究利用了由Hort，Penfold和Siebert開(kāi)發(fā)的兔子模型，合作的結(jié)果導(dǎo)致在1942年的USP第12版中包括了第一個(gè)藥典熱原試驗(yàn)。該試驗(yàn)需要靜脈注射溶液和一組兔子的直腸溫度測(cè)量三個(gè)小時(shí)。

在1964年至1968年期間，Levin和Bang報(bào)道革蘭氏陰性細(xì)菌內(nèi)毒素具有凝結(jié)大西洋馬蹄蟹血液的能力。他們確定對(duì)血液中細(xì)菌內(nèi)毒素的敏感性（源自革蘭氏陰性細(xì)菌）是由于其血細(xì)胞，變形細(xì)胞中的酶。由于測(cè)試是基于鱟（血鱟），并且由于所述酶從獲得的鱟細(xì)胞通過(guò)裂解具有高純度的蒸餾水，試驗(yàn)被評(píng)為鱟變形細(xì)胞溶解物，或LAL。Levin and Cooper于1971年發(fā)表的一篇文章報(bào)道說(shuō)，與RPT相比、LAL（鱟試劑）更靈敏且成本更低。 它激發(fā)了全世界對(duì)于確定BET作為RPT替代品的適用性的興趣。

1973年，F(xiàn)DA公布了用于生產(chǎn)LAL的擬議生產(chǎn)規(guī)范。LAL的制造商必須在使用前向FDA提交每批樣品以進(jìn)行測(cè)試。臨時(shí)使用LAL可使行業(yè)獲得實(shí)際經(jīng)驗(yàn)。常規(guī)上使用創(chuàng)新的LAL測(cè)試來(lái)測(cè)試原材料，過(guò)程中的樣品，首批（FOB）和批中（MOB）樣品。批次結(jié)束（EOB）樣品需要兔子測(cè)試，因?yàn)镋OB被認(rèn)為是最壞的情況。

最大的醫(yī)療設(shè)備和LVP生產(chǎn)商Baxter Travenol認(rèn)識(shí)到LAL測(cè)試的簡(jiǎn)單性和耐用性，于1973年做出了一項(xiàng)公司決定，將LAL驗(yàn)證為其全球設(shè)施的內(nèi)毒素測(cè)試。在1979年和1982年，他們報(bào)告了其年度內(nèi)毒素檢測(cè)結(jié)果。這些數(shù)據(jù)包括66594 USP兔熱原測(cè)試和356548 LAL測(cè)試。值得注意的是，兩種方法均測(cè)試了404個(gè)自然污染的樣品。LAL測(cè)試確認(rèn)了內(nèi)毒素的存在，所有404個(gè)樣品均未通過(guò)測(cè)試。但是，按照USP第<151>章熱原測(cè)試，對(duì)所有404個(gè)樣品進(jìn)行的八次兔子測(cè)試僅導(dǎo)致19次失敗。這些數(shù)據(jù)明確表明，LAL是更靈敏的方法，革蘭氏陰性細(xì)菌內(nèi)毒素是對(duì)腸胃外產(chǎn)品制造影響最大的熱原。這些數(shù)據(jù)和45年的經(jīng)驗(yàn)證明了LAL測(cè)試的特異性（檢測(cè)一系列內(nèi)毒素的能力）。如下表1所示。

現(xiàn)在

商業(yè)重組蛋白正在被開(kāi)發(fā)，以替代目前在藥典中定義的天然來(lái)源的LAL試劑。三種產(chǎn)品均基于因子C，這是LAL級(jí)聯(lián)中的第一個(gè)內(nèi)毒素結(jié)合因子。還正在開(kāi)發(fā)包含亞洲（Tachypleus）和美國(guó)（Limulus）馬蹄蟹物種的所有三種凝血因子的重組產(chǎn)品。旨在證明當(dāng)前藥典方法與重組方法等效的研究很大程度上是基于對(duì)純化LPS的比較檢測(cè)或注射用水（WFI）的清潔樣品的比較確定的。然而，這些研究并未解決特異性問(wèn)題，即檢測(cè)多種天然環(huán)境內(nèi)毒素的能力。

幾項(xiàng)研究已使用環(huán)境內(nèi)毒素將rFC與LAL進(jìn)行了比較。Thorne等人檢查了10家畜牧生產(chǎn)設(shè)施的空氣樣本。研究設(shè)計(jì)，樣本量和統(tǒng)計(jì)評(píng)估都非常出色。但是，來(lái)自牲畜設(shè)施的空氣樣本并不代表制藥生產(chǎn)環(huán)境。另外，在此采樣中與細(xì)菌相關(guān)的內(nèi)毒素更可能代表腸道，而不是通常居住在水系統(tǒng)中的非發(fā)酵罐。Kikuchi確實(shí)檢查了來(lái)自各種水源的環(huán)境內(nèi)毒素。樣品集非常有限，但是盡管如此，數(shù)據(jù)表明重組方法可能會(huì)低估自然污染水的內(nèi)毒素濃度。

Akers等。最近比較了所有目前比較rFC和LAL的文獻(xiàn)。他們的審查得出的結(jié)論是，當(dāng)前可獲得的所有數(shù)據(jù)都證明了rFC的適用性，但沒(méi)有證明可比性。他們注意到，大多數(shù)聲稱(chēng)具有可比性的已發(fā)表研究包括來(lái)自測(cè)試文章的數(shù)據(jù)，這些數(shù)據(jù)在制造過(guò)程的任何環(huán)節(jié)中均沒(méi)有可測(cè)量的自身內(nèi)毒素活性。當(dāng)測(cè)試物品中的被測(cè)雜質(zhì)（在這種情況下為內(nèi)毒素活性）處于可定量水平時(shí)，就無(wú)法主張可比性。分析物（RSE或CSE）的回收率在實(shí)驗(yàn)上并未確認(rèn)替代方法回收天然產(chǎn)物污染物的能力。

Charles River最近完成了一項(xiàng)評(píng)估，該評(píng)估同時(shí)檢查了三種市售重組C因子產(chǎn)品，正在開(kāi)發(fā)的單個(gè)重組LAL級(jí)聯(lián)和兩種FDA許可的LAL試劑。來(lái)自歐洲腸胃外生產(chǎn)設(shè)施的藥物預(yù)處理水樣品用于評(píng)估重組試劑的特異性。這項(xiàng)研究利用了統(tǒng)計(jì)學(xué)上相關(guān)的樣本集。它證明了所有重組試劑都有可能低估天然內(nèi)毒素的濃度。低估不是由于LAL試劑的葡聚糖偏差造成的，因?yàn)轸燃谆哪z多糖被用作Charles River LAL試劑的葡聚糖阻滯劑，并且兩種LAL試劑均產(chǎn)生相似的結(jié)果。另外，這項(xiàng)研究的結(jié)果表明，所有重組產(chǎn)品都需要進(jìn)一步開(kāi)發(fā)，以檢測(cè)108年前Hort，Penfold和Seibert鑒定出的發(fā)燒體（內(nèi)毒素）。

未來(lái)

測(cè)量和檢測(cè)居住在純凈水系統(tǒng)中的微生物群落產(chǎn)生的所有內(nèi)毒素的能力（Burkholderiaceae，Methylobacteriaceae，Comamonadaceae類(lèi)/科的成員）對(duì)于WFI系統(tǒng)的操作控制絕對(duì)必要。目前，LAL測(cè)試的重組替代品不能始終如一地做到這一點(diǎn)。必須在重組蛋白質(zhì)化學(xué)或重組制劑方面取得進(jìn)一步進(jìn)展。對(duì)LAL重組替代品的提煉必須考慮對(duì)天然環(huán)境內(nèi)毒素的反應(yīng)性，而不是高度純化的脂多糖標(biāo)準(zhǔn)品。藥典LAL測(cè)試與任何重組替代品之間的差異必須科學(xué)解決。與1980年代初期采用LAL測(cè)試類(lèi)似，

LAL不是單一酶，LAL不是三種酶，LAL確實(shí)包含三種蛋白酶酶原，已知它們與細(xì)菌內(nèi)毒素的順序激活有關(guān)。LAL還包含對(duì)β1-3葡聚糖敏感的G因子酶。LAL包含可溶性蛋白質(zhì)凝結(jié)原，可通過(guò)活化的凝血酶將其轉(zhuǎn)化為不溶性凝膠。LAL還包含三種絲氨酸蛋白酶抑制劑樣蛋白，可調(diào)節(jié)LAL內(nèi)毒素和葡聚糖激活級(jí)聯(lián)反應(yīng)。LAL包含抗LPS因子，可中和細(xì)菌內(nèi)毒素，抗微生物肽，α2-巨球蛋白，大防御素和胱抑素。LAL是鱟450萬(wàn)年原始的免疫系統(tǒng)，和人類(lèi)鱟將繼續(xù)作為針對(duì)人類(lèi)和動(dòng)物注射藥物的有效且可靠的安全性測(cè)試。我們認(rèn)識(shí)到，人們對(duì)大西洋horse的種群可持續(xù)性存在擔(dān)憂。Charles River開(kāi)發(fā)了一種基于彈藥的微流LAL測(cè)試，該測(cè)試可將LAL資源減少至95％。Charles River和所有FDA許可的LAL制造商，數(shù)十年來(lái)都制定了保護(hù)和教育計(jì)劃，以確保對(duì)這一杰出物種的保護(hù)。

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