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摘 要

 

本文討論了紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（UV-VISS）的光度準(zhǔn)確度（Photometric Accuracy；以下簡(jiǎn)稱PA；PA是吸光度理論值A(chǔ)0與實(shí)際測(cè)量值A(chǔ)之差）的重要性；指出了影響 UV-VISS的PA的主要因素；提出了如何保證或提高UV-VISS的PA的主要途徑。

 

前 言

分析儀器是是集光、機(jī)、電、計(jì)算機(jī)四為一體的、技術(shù)密集的、高科技產(chǎn)品，分析儀器及其應(yīng)用的發(fā)展速度非?？靃1]。UV-VISS是當(dāng)今世界上歷史最悠久、使用最多、覆蓋面最廣的分析儀器之一；目前，國(guó)際上有數(shù)百家從事 UV-VISS生產(chǎn)的廠商，但是，在UV-VISS的PA這個(gè)最重要、最關(guān)鍵的技術(shù)指標(biāo)的表示方法、給出的數(shù)據(jù)等方面，絕大多數(shù)都存在嚴(yán)重問(wèn)錯(cuò)誤；首先， PA的表示方法方面，目前，國(guó)際上一般都用透過(guò)率誤差（△T）或吸光度誤差（△A）表示。有的廠商同時(shí)給出△T和△A，但有的廠商只給△T或△A 。作者認(rèn)為這兩種給法都是可以的

但作者研究表明：在單獨(dú)給出△T或△A或同時(shí)給出△T和△A 的廠商中，絕大多數(shù)都沒(méi)有搞清△T和△A 的關(guān)系，所以給出的數(shù)據(jù)都是錯(cuò)誤的（主要表現(xiàn)在給出的△T和△A是相互矛盾的；△T在儀器整個(gè)T 值的范圍內(nèi)都達(dá)不到）。目前為止，只有美國(guó) P-E的Lambd9[2]等少數(shù)UV-VISS給出的△T或△A或同時(shí)給出的△T和△A是正確的。因此，作者曾將這些錯(cuò)誤稱之為國(guó)際性的錯(cuò)誤。

作者[5]經(jīng)過(guò)認(rèn)真的、深入的研究，發(fā)現(xiàn)Shimadzu、Hitachi、GBC和中國(guó)的大多數(shù)廠商，都是只要自認(rèn)為自己生產(chǎn)的UV-VISS屬于所謂高檔儀器，就在0-100%T的范圍內(nèi)，將△T都千篇一律寫(xiě)為：± 0.3%T。同時(shí)，對(duì)應(yīng)的△A都寫(xiě)為：0-0.5Abs內(nèi)時(shí)為±0.002Abs、0.5-1Abs內(nèi)時(shí)為± 0.004Abs。同樣，這也是一個(gè)國(guó)際性的錯(cuò)誤。

作者對(duì)這個(gè)問(wèn)題作了深入研究[7] ，從比耳定律出發(fā)，推出了一個(gè)科學(xué)的、復(fù)雜的計(jì)算公式，并據(jù)此計(jì)算出七十多張表格。同時(shí)據(jù)表格作出了一組曲線圖。下面是其中的一張表和曲線圖（詳見(jiàn)：李昌厚等，現(xiàn)代科學(xué)儀器，2000年，第一期，第24頁(yè)）：

從上述表和圖，可以清楚的看出：當(dāng)△T ＝0.3%T時(shí)，若吸光度為0.5A，△A不是0.002A,而是0.0041A；若吸光度為1.0 A，△A不是0.004A，而是0.0128A。

△T和△A產(chǎn)生上述錯(cuò)誤現(xiàn)象的主要原因有三個(gè)：

　　第一，未深入研究，不懂得△T和T0 （透過(guò)率真值）的關(guān)系，不懂得△A和A0（吸光度真值）的關(guān)系，不懂得影響△T和△A的主要因素；

　　第二，人云亦云，不管對(duì)不對(duì)，你這樣寫(xiě)，我也盲目的這樣寫(xiě)；

　　第三，商業(yè)上的需要，人家給的± 0.3 %T ，我如不這樣寫(xiě)，就擔(dān)心會(huì)影響儀器的銷售。

本文將從研發(fā)、生產(chǎn)、使用三者的角度，研究、討論 PA 及其有關(guān)問(wèn)題。

 

一、UV-VISS的PA的重要性

 

什么叫 UV-VISS 的PA？簡(jiǎn)言之，UV-VISS 對(duì)某試樣吸光度的實(shí)際測(cè)量值與該試樣吸光度真值（實(shí)際測(cè)量值）之差就叫 PA 。它是 UV-VISS 可靠性的核心問(wèn)題，也是使用者最關(guān)心的核心問(wèn)題。

 

什么叫可靠性？長(zhǎng)期以來(lái)，國(guó)際上都很重視可靠性這個(gè)問(wèn)題，研究者很多。綜合文獻(xiàn)并結(jié)合作者的實(shí)踐，作者提出：可靠性可分為狹義和廣義兩種[4]、[5]；狹義可靠性是指?jìng)鹘y(tǒng)的可靠性，主要指儀器的設(shè)計(jì)、制造方面的故障率（含元器件），但是它沒(méi)有考慮到使用者的數(shù)據(jù)準(zhǔn)確度、可靠性等這些關(guān)鍵問(wèn)題；而廣義的可靠性則應(yīng)包括儀器的故障率、準(zhǔn)確度、漂移、重復(fù)、售后服務(wù)等；這樣，既考慮了研發(fā)、生產(chǎn)者的問(wèn)題，也考慮到了廣大使用者的實(shí)際使用要求。

 

儀器故障率高、安全性差，當(dāng)然是不可靠。但測(cè)量的數(shù)據(jù)不準(zhǔn)確，出了故障不能及時(shí)排除，更是不可靠。對(duì)用戶來(lái)講，一臺(tái)UV-VISS，如果分析測(cè)試的結(jié)果不準(zhǔn)確，就是最大的不可靠。所以，任何UV-VISS的設(shè)計(jì)者、生產(chǎn)者，都希望自己作出的UV-VISS具有很高的PA；任何使用者都希望自己使用的UV-VISS具有很高的PA。

 

任何UV-VISS的使用者都要求自己使用的儀器穩(wěn)定可靠；對(duì)用戶來(lái)講，所謂穩(wěn)定，就是漂移小，重復(fù)性好。所謂可靠，就是測(cè)量結(jié)果準(zhǔn)確（測(cè)量結(jié)果誤差?。?、故障率小，出了故障能及時(shí)排除。穩(wěn)定可靠，是一切UV-VISS使用者選擇儀器的宗旨。因此，PA應(yīng)是UV-VISS的設(shè)計(jì)者、生產(chǎn)者和使用者們共同最關(guān)心、最重要的關(guān)鍵技術(shù)指標(biāo)。

 

二、影響 PA 最主要的因素

 

作者經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期實(shí)踐、反復(fù)研究，認(rèn)為影響PA最主要、最關(guān)鍵的因素，可用下述數(shù)學(xué)表達(dá)式描述：

PA=f(SL、N、BF、SBW)

　式中：PA  -光度準(zhǔn)確度（Photometric Accuracy）

　SL  -雜散光（Stray Light）

　N  -噪聲(Nois)

　BF  -基線平直度(Baisline Flat；表征全波段每個(gè)波長(zhǎng)上的噪聲)

　SBW  -光譜帶寛(Spectral Band Width)

 

1. SL：

UV-VISS 的SL非常重要，它產(chǎn)生光噪聲、直接限制被分析測(cè)試試樣濃度的上限。它是目前國(guó)際上所有用戶最關(guān)心的問(wèn)題之一。目前，國(guó)際上有許多專家學(xué)者都在研究SL。下面是 Owen[12] 的研究結(jié)果（見(jiàn)圖1）：從圖1可明顯看出，不同的SL，偏離比耳定律的程度不同（產(chǎn)生的誤差不同）。

  

圖1 不同SL偏離比耳定律

作者[6]和Shape[5]的研究表明：在試樣濃度為2Abs時(shí)測(cè)試，若UV-VISS儀器有0.1%的SL，則可產(chǎn)生5%的相對(duì)誤差（△A/A0）；若在 0.434Abs 處測(cè)試，儀器的 SL為0.5% ，則分析結(jié)果的相對(duì)誤差（△A/A0）就會(huì)超過(guò)1% ，就不能滿足某些藥物分析工作的要求.

 

作者發(fā)現(xiàn)：在SL問(wèn)題上，國(guó)外有些廠商對(duì)此很不負(fù)責(zé)任的亂宣傳。如日本的島津，它的2501PC[8] UV-VISS曾經(jīng)自稱是世界上最高級(jí)的 UV-VISS，他們?cè)跇颖旧蠈?xiě)著：分析測(cè)試的試樣的濃度可達(dá) 9Abs。而當(dāng)時(shí)美國(guó)PE公司推出的Lambda 900、美國(guó)Varia公司的Cary500的SL都為8x10-7，,但比較實(shí)在的給出測(cè)試的吸光度上限為5-6Abs（經(jīng)作者測(cè)試，認(rèn)為5.5Abs基本可靠）。

 

作者從理論上和實(shí)踐上對(duì)2501PC進(jìn)行了認(rèn)真的研究，發(fā)現(xiàn)2501PC 樣本上[8]提供的 SL為3ⅹ10-6，根據(jù)比耳定律和雜散光理論，作者計(jì)算的結(jié)果，在9Abs時(shí)，該儀器的分析測(cè)試的絕對(duì)誤差△A在 3Abs以上。這種分析測(cè)試結(jié)果的可靠性極差，毫無(wú)實(shí)用價(jià)值。所以，2501PC 提供的所謂可測(cè)到9Abs是不實(shí)用的虛指標(biāo)，是無(wú)意義的。

 

作者對(duì)SL進(jìn)行了深入研究；從比耳定律出發(fā)，推出了一個(gè)很科學(xué)、很復(fù)雜的計(jì)算公式[7]，并據(jù)此計(jì)算出七十幾張表，同時(shí)據(jù)表作出一組曲線圖（見(jiàn)圖2）。

圖2 SL對(duì)△A/A影響的研究

從圖2也可簡(jiǎn)明的看出：在試樣為2Abs處測(cè)試，若儀器有0.1% 的 SL，則可產(chǎn)生5% 的相對(duì)誤差（△A/A0）；若在 0.434 Abs 處測(cè)試，儀器的SL為0.5% ，則分析結(jié)果的相對(duì)誤差（△A/A0）就會(huì)超過(guò)1% ，就不能滿足某些藥物分析工作的要求。

 

2 .N ：

 

UV-VISS的N[9]，包括光N和電N；光N由光源的發(fā)光強(qiáng)度分布因子所產(chǎn)生，電N由光電倍增管（PMT）、各類電源、放大器等電子學(xué)部分所引起。N是UV-VISS 的最重要的關(guān)鍵技術(shù)指標(biāo)之一，它直接限制 UV-VISS 的檢測(cè)下限（靈敏度）。因此，必須重視對(duì)N的研究。

作者[11]的研究表明：若要滿足藥典的要求（某些藥物分析測(cè)試的相對(duì)誤差要求為1%），則在試樣的吸光度為0.05Abs時(shí)，儀器在測(cè)試波長(zhǎng)處的N必須達(dá)到±0.0005 Abs。而目前，日本和中國(guó)的許多UV-VISS 的生產(chǎn)廠家并未重視這個(gè)問(wèn)題。許多廠商的樣本不給出儀器的N（如Shimadzu 的2401PC、2501PC等），這就意味著他們生產(chǎn)的 UV-VISS 的檢測(cè)下限是未知的。有的廠商給出了儀器的 N，但是太大，不能滿足藥典的要求。這些問(wèn)題是使用者挑選UV-VISS儀器時(shí)必須重視的問(wèn)題。

作者認(rèn)為，只要認(rèn)真研究 N，真正認(rèn)識(shí)了N的重要性，并在實(shí)踐

中重視降低N，我國(guó)的UV-VISS就會(huì)上一個(gè)新的臺(tái)階。例如：我國(guó)的北京普析通用公司，由于重視了對(duì)N的研究，他們的 UV-VISS（ TU-1901、T10等）的N達(dá)到了±0.0004Abs，與目前國(guó)際上最高級(jí)的UV-VISS之一的美國(guó)PE公司的Lambda900[3]處在同一個(gè)數(shù)量級(jí)上（Lambda900的N為±0.0002Abs）。

綜上所述，UV-VISS的研發(fā)者、設(shè)計(jì)者、制造者在生產(chǎn)儀器時(shí)、使用者在挑選儀器時(shí)，都必須特別重視儀器的N這個(gè)非常重要的技術(shù)指標(biāo)。

作者對(duì)N進(jìn)行了深入研究，研究的結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 N對(duì)△A/A影響的研究

 

3.BF

 

BF是指UV-VISS儀器全波段內(nèi)，每個(gè)波長(zhǎng)上的N[11]，它直接影響UV-VISS的靈敏度或檢測(cè)下限和使用范圍，是一個(gè)非常重要的技術(shù)指 標(biāo)。是使用者挑選和使用UV-VISS時(shí)，特別要重視的技術(shù)指標(biāo)之一。它也是目前國(guó)內(nèi)外有關(guān)的科技工作者，還未引起足夠重視的技術(shù)指標(biāo)之一。

因?yàn)檎麢C(jī)的N是在500nm處測(cè)試的，它只能表示500nm處的N；而用戶在使用儀器時(shí)，一般都不只是用在在500nm，并且，大多數(shù)用在紫外區(qū)。所以，每個(gè)波長(zhǎng)上的N，特別是紫外區(qū)的各個(gè)波長(zhǎng)上的N,就顯得特別重要。我國(guó)有好多廠商給出的BF為±0.004Abs；作者認(rèn)為BF為±0.004Abs的UV-VISS儀器，遠(yuǎn)不能滿足我國(guó)藥典要求相對(duì)誤差為1％的藥物分析工作要求。作者作DNA分析測(cè)試時(shí)，要求相對(duì)誤差為1％，但試樣的吸光度常在0.08-0.1Abs。開(kāi)始，曾想用某某儀器，因其BF為±0.004Abs，分析相對(duì)誤差為1.5％，不能滿足相對(duì)誤差為1％的要求，故改用±0.001Abs的儀器（TU-1901），完全能滿足相對(duì)誤差為1％的要求，效果很好。

 

4. SBW：

 

UV-VISS 的SBW非常重要，它是影響 UV-VISS的PA的主要因素之一。T.Owen 的研究結(jié)果[12]見(jiàn)圖4，它能清楚的說(shuō)明這個(gè)問(wèn)題；用1nm的SBW，能分出兩個(gè)很好的峰。用20nm的SBW，兩個(gè)峰就變?yōu)轳R鞍形,如用50 nm的SBW，則兩個(gè)峰變?yōu)橐粋€(gè)峰。由此可知，SBW多么重要。

圖4 SBW對(duì)PA的影響

SBW對(duì)PA的影響，還可從下面的例子看出：作者曾經(jīng)在5nm的SBW時(shí)，測(cè)試細(xì)胞色素C，結(jié)果產(chǎn)生30%左右的誤差。作者還發(fā)現(xiàn)：在SBW=2nm時(shí)，測(cè)試細(xì)胞色素C，會(huì)產(chǎn)生10%左右的誤差。只有SBW為0.3nm時(shí)，測(cè)試結(jié)果才能真正反映出細(xì)胞色素C的實(shí)際的吸光度值（1%以內(nèi)的誤差）。

又如：青霉素鈉、青霉素鉀也是如此；我國(guó)藥典曾經(jīng)規(guī)定：作青霉素鈉、青霉素鉀時(shí)，要求SBW=1nm。其實(shí)這也是不對(duì)的；作者的實(shí)踐表明：在藥典規(guī)定的條件下，SBW為2nm時(shí)，測(cè)試值為0.805Abs；在SBW為1.0nm時(shí)，測(cè)試值為0.825Abs和 SBW為0.3nm時(shí)，測(cè)試值為0.865Abs。SBW為0.2nm時(shí)，測(cè)試值為0.845Abs .0.3nm和1.0nm相差0.04Abs相對(duì)誤差為4.7%。這足以說(shuō)明SBW的重要性。所以，必須要非常重視對(duì) UV-VISS 的SBW的選擇。特別是藥檢工作者，在挑選 UV-VISS 時(shí)，更要注意 SBW。一般來(lái)講，固定 SBW的UV-VISS，不宜用在藥檢和科研工作中，否則，會(huì)產(chǎn)生很大的分析誤差。因此，制造者、使用者都必須高度重視SBW 的問(wèn)題。

目前，我國(guó)還有不少藥廠用 SBW=5nm或 更大的、固定SBW的 UV-VISS（如752、753、754等）作為質(zhì)量控制儀器，這是不對(duì)的，應(yīng)該改用 SBW ≤2nm 的UV-VISS才對(duì)。云南保山地區(qū)藥檢系統(tǒng)某某單位曾經(jīng)買島津的UV-1206 UV-VISS作質(zhì)檢，該儀器的SBW=5nm；所以UV-1206根本不能用作藥檢。藥典為何要規(guī)定用2nm的SBW？這是有科學(xué)根據(jù)的；因?yàn)锳.Owen[11]的研究表明：若SBW/NBW（即光譜帶寬/自然帶寬）= 0.1時(shí)，則能滿足世界上99%以上的試樣的分析，其分析準(zhǔn)確度可達(dá)到99.5%。而地球上有機(jī)試樣的自然帶寬一般都在20nm 左右。所以，如果 UV-VISS的SBW=2nm，則此時(shí)SBW)/20(NBW=0.1，基本上能滿足99%的藥品分析檢驗(yàn)工作的要求。并且，分析測(cè)試的準(zhǔn)確度為99.5% [11]。所以，中國(guó)和許多國(guó)家的藥典都規(guī)定用于藥品質(zhì)控的 UV-VISS，必須要求SBW≤2nm，就是這個(gè)道理。

 

三、如何保證或提高 UV-VISS 的 PA

 

1. UV-VISS儀器的研發(fā)者（設(shè)計(jì)者）必須做到五個(gè)認(rèn)真：

① 認(rèn)真開(kāi)展有關(guān) PA 的基本理論研究；重視儀器學(xué)理論[13] 、真正搞清 △A 、△T的關(guān)系，必須給出正確的PA值。

②認(rèn)真開(kāi)展對(duì)PA、SL、N、BF 、 SBW 等相互關(guān)系的研究，真正搞清其相互關(guān)系和對(duì)分析誤差的影響，正確給出這些技術(shù)指標(biāo)。

③認(rèn)真開(kāi)展影響 PA 的主要因素的研究；并在實(shí)踐中用來(lái)指導(dǎo)生產(chǎn)和使用工作。

④認(rèn)真開(kāi)展 PA 測(cè)試方法的研究；準(zhǔn)確的測(cè)出 PA。

⑤認(rèn)真與使用者溝通，不斷了解用戶對(duì) PA 的要求。

 

2 .生產(chǎn)者應(yīng)該做到五個(gè)必須：

① 必須對(duì)元器件進(jìn)行嚴(yán)格篩選（含光源、光柵等光學(xué)元件和PMT、集成塊等電子元器件），以保證整機(jī)質(zhì)量、保證PA準(zhǔn)確可靠。

② 必須有嚴(yán)格的生產(chǎn)工藝。特別是裝校工藝和質(zhì)量檢驗(yàn)工藝。

③ 必須對(duì)儀器的性能指標(biāo)進(jìn)行全面測(cè)試（含、SL、N、SBW、BF、PA、比色皿配對(duì)等）。

④ 必須對(duì)元部件作全面測(cè)試；含各類電源、放大器、電光源系統(tǒng)等的性能指標(biāo)測(cè)試。

⑤ 必須與用戶保持聯(lián)系，加強(qiáng)售后服務(wù)。

 

3 .使用者做到五個(gè)認(rèn)真：

① 認(rèn)真學(xué)習(xí)儀器學(xué)理論[13]，了解儀器指標(biāo)與分析誤差的關(guān)系，了解儀器基本結(jié)構(gòu)，掌握主要技術(shù)指標(biāo)的基本測(cè)試方法，經(jīng)常自己檢測(cè)儀器，工作中認(rèn)真選擇儀器條件，力爭(zhēng)把儀器用在最佳狀態(tài)。

② 認(rèn)真按說(shuō)明書(shū)的要求操作儀器，切不可違反說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

③ 認(rèn)真進(jìn)行儀器的日常維護(hù)，保持室內(nèi)清潔，注意控制室內(nèi)溫度和濕度。

④ 認(rèn)真作好試樣的前處理，減少因試樣的前處理而帶來(lái)的比耳定律偏離。（如防止試樣光解、污染等）

⑤ 認(rèn)真總結(jié)使用儀器的經(jīng)驗(yàn)。經(jīng)常與生產(chǎn)廠保持聯(lián)系。經(jīng)常參加分析儀器行業(yè)的學(xué)術(shù)交流會(huì)。

 

四、結(jié)束語(yǔ)

 

PA是UV-VISS 最重要的關(guān)鍵技術(shù)指標(biāo)之一；SL、N、BF 和 SBW 是影響 PA的最主要的因素。所以，重視 UV-VISS 的PA的研究，首先就應(yīng)特別重視 UV-VISS 的 SL、N、BF 和 SBW 的研究。只有研發(fā)者、設(shè)計(jì)者、生產(chǎn)者、使用者共同努力，認(rèn)真研究SL、N、BF 和 SBW，才能真正保證提高我國(guó) UV-VISS的PA。

 

參考文獻(xiàn)

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[13]李昌厚，儀器學(xué)理論與實(shí)踐，北京：科學(xué)出版社，2008。