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【導(dǎo)讀】高效液相色譜的系統(tǒng)適用性試驗(yàn)通常包括理論塔板數(shù)、分離度、靈敏度、拖尾因子和重復(fù)性等五個(gè)參數(shù)。常規(guī)檢驗(yàn)工作中，應(yīng)按各品種正文項(xiàng)下要求對色譜系統(tǒng)進(jìn)行適用性試驗(yàn)，即用規(guī)定的對照品溶液或系統(tǒng)適用性試驗(yàn)溶液對色譜系統(tǒng)進(jìn)行試驗(yàn)，必要時(shí)，可對色譜系統(tǒng)進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整，以達(dá)到規(guī)定的要求。

ICHQ2中關(guān)于系統(tǒng)適用性試驗(yàn)的論述為: 許多分析方法的必要組成部分。該試驗(yàn)是把分析設(shè)備、電子儀器、實(shí)驗(yàn)操作和被分析樣品作為一個(gè)整體來進(jìn)行評價(jià)。系統(tǒng)適用性試驗(yàn)參數(shù)是根據(jù)被論證的方法類型，針對某一特定方法而建立的。通常通過耐用性評估，建立一系列系統(tǒng)適用性參數(shù)(如分離度試驗(yàn)) ，以確保該分析方法在任何時(shí)候使用均有效。

一、系統(tǒng)適用性試驗(yàn)要求

     對比各國藥典色譜法系統(tǒng)適用性試驗(yàn)要求，內(nèi)容基本一致，均包括理論板數(shù)、分離度、拖尾因子、重復(fù)性和靈敏度。具體要求略有差異，《中國藥典》色譜法項(xiàng)下系統(tǒng)適用性試驗(yàn)要求更加明確，但目前各論中收載的品種項(xiàng)下的系統(tǒng)適用性要求卻是低的。美國藥典通則色譜法項(xiàng)下系統(tǒng)適用性要求并不明確，但在其各論中系統(tǒng)適用性要求卻是最多最具體的，這一點(diǎn)也體現(xiàn)了中美研究者對系統(tǒng)適用性試驗(yàn)認(rèn)識(shí)和研究深度的差異。

       通則0512液相法提到的系統(tǒng)適用性要求:①理論板數(shù)。應(yīng)指明測定物質(zhì)，一般為待測物質(zhì)或內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的理論板數(shù)。②分離度。除另有規(guī)定外，待測物質(zhì)色譜峰與相鄰色譜峰之間的分離度應(yīng)大于1． 5。③靈敏度，定量測定時(shí)，信噪比不小于10，定性測定時(shí)，信噪比不小于3。系統(tǒng)適用性試驗(yàn)中可以設(shè)置靈敏度試驗(yàn)溶液，來評價(jià)色譜系統(tǒng)的檢測能力。④拖尾因子( T) 。除另有規(guī)定外，應(yīng)在0.95 ～1. 05 之間。⑤重復(fù)性。相對標(biāo)準(zhǔn)偏差應(yīng)不大于2.0%。

二 、 色譜柱的理論塔板數(shù)(n)

理論塔板數(shù)用于評價(jià)色譜柱的分離效能。由于不同物質(zhì)在同一色譜柱上的色譜行為不同，采用理論塔板數(shù)作為衡量柱效能的指標(biāo)時(shí)，應(yīng)指明測定物質(zhì)，一般為待測物質(zhì)或內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的理論塔板數(shù)。在規(guī)定的色譜條件下，注入供試品溶液或各品種項(xiàng)下規(guī)定的內(nèi)標(biāo)物質(zhì)溶液，記錄色譜圖，量出供試品主成分色譜峰或內(nèi)標(biāo)物質(zhì)色譜峰的保留時(shí)間tR和峰寬(W)或半高峰寬(Wh/2)，按n=16(tR/W)²或n=5.54(tR/Wh/2)2計(jì)算色譜柱的理論塔板數(shù)。tR、W、Wh/2可用時(shí)間或長度計(jì)，但應(yīng)取相同單位。

三 、 分離度(R)

分離度用于評價(jià)待測物質(zhì)與被分離物質(zhì)之間的分離程度，是衡量色譜系統(tǒng)分離效能的關(guān)鍵指標(biāo)?？梢酝ㄟ^測定待測物質(zhì)與已知雜質(zhì)的分離度，也可以通過測定待測物質(zhì)與某一指標(biāo)性成分(內(nèi)標(biāo)物質(zhì)或其他難分離物質(zhì))的分離度，或?qū)⒐┰嚻坊驅(qū)φ掌酚眠m當(dāng)?shù)姆椒ń到?，通過測定待測物質(zhì)與某一降解產(chǎn)物的分離度，對色譜系統(tǒng)分離效能進(jìn)行評價(jià)與調(diào)整。

無論是定性鑒別還是定量測定，均要求待測物質(zhì)色譜峰與內(nèi)標(biāo)物質(zhì)色譜峰或特定的雜質(zhì)對照色譜峰及其他色譜峰之間有較好的分離度。除另有規(guī)定外，待測物質(zhì)色譜峰與相鄰色譜峰之間的分離度應(yīng)大于1.5。分離度的計(jì)算公式為：

式中，tR2為相鄰兩色譜峰中后一峰的保留時(shí)間；tR1為相鄰兩色譜峰中前一峰的保留時(shí)間；W1、W2及W1,h/2、W2,h/2分別為此相鄰兩色譜峰的峰寬及半高峰寬。

當(dāng)對測定結(jié)果有異議時(shí)，色譜柱的理論塔板數(shù)(n)和分離度(R)均以峰寬(W)的計(jì)算結(jié)果為準(zhǔn)。

四  、靈敏度

靈敏度用于評價(jià)色譜系統(tǒng)檢測微量物質(zhì)的能力，通常以信噪比(S/N)來表示。通過測定一系列不同濃度的供試品或?qū)φ掌啡芤簛頊y定信噪比。定量測定時(shí)，信噪比應(yīng)不小于10；定性測定時(shí)，信噪比應(yīng)不小于3。系統(tǒng)適用性試驗(yàn)中可以設(shè)置靈敏度測試溶液來評價(jià)色譜系統(tǒng)的檢測能力。

五 、拖尾因子(T)

拖尾因子用于評價(jià)色譜峰的對稱性。拖尾因子計(jì)算公式為：

T=W0.05h/2d1............

式中，W0.05h為5%峰高處的峰寬；d1為峰頂在5%峰高處橫坐標(biāo)平行線的投影點(diǎn)至峰前沿與此平行線交點(diǎn)的距離。

 以峰高作定量參數(shù)時(shí)，除另有規(guī)定外，T值應(yīng)在0.95～1.05之間。以峰面積作定量參數(shù)時(shí)，一般的峰拖尾或前伸不會(huì)影響峰面積積分，但嚴(yán)重拖尾會(huì)影響基線和色譜峰起止的判斷和峰面積積分的準(zhǔn)確性，此時(shí)應(yīng)在品種正文項(xiàng)下對拖尾因子作出規(guī)定。

除另有規(guī)定外，峰高法定量時(shí)T應(yīng)在0.95～1.05之間。峰面積法測定時(shí)，若拖尾嚴(yán)重，將影響峰面積的準(zhǔn)確測量。必要時(shí)，可依據(jù)情況對拖尾因子作出規(guī)定。

    《中國藥典》四部高效液相色譜法(通則0512)中規(guī)定了各品種項(xiàng)下規(guī)定的色譜條件可在一定范圍內(nèi)調(diào)節(jié)，但沒有規(guī)定具體內(nèi)容。參照國外藥典，以下調(diào)節(jié)范圍可選擇參考：

a—柱長(-50%到+100%)，柱內(nèi)徑(±25%)；

b—填料粒徑(-50%)；

c—流速(±5%)；

d—流動(dòng)相的pH(±0.5pH單位)；

e—緩沖鹽濃度(相對濃度±30%，絕對濃度±2%)；

f—進(jìn)樣體積可減小至可接受的定量精度；

g—柱溫(±10℃)。

由于各色譜條件對分離效果具有累積效應(yīng)，應(yīng)避免同時(shí)調(diào)節(jié)多項(xiàng)條件。

六 、 重復(fù)性

重復(fù)性用于評價(jià)色譜系統(tǒng)連續(xù)進(jìn)樣時(shí)響應(yīng)值的重復(fù)性能。采用外標(biāo)法時(shí)，通常取各品種項(xiàng)下的對照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣5次，除另有規(guī)定外，其峰面積測量值的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差應(yīng)不大于2.0%；采用內(nèi)標(biāo)法時(shí)，通常配制相當(dāng)于80%、100%和120%的對照品溶液，加入規(guī)定量的內(nèi)標(biāo)溶液，配成3種不同濃度的溶液，分別至少進(jìn)樣2次，計(jì)算平均校正因子，其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差應(yīng)不大于2.0%。