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在新藥申報資料中，藥品質(zhì)量控制部分包括質(zhì)量標準、放行檢測數(shù)據(jù)、分析方法、分析方法驗證和質(zhì)量標準接受限度的說明，其中分析方法驗證是最基本的組成要素，它影響著分析數(shù)據(jù)的可靠性和一致性。

 

對于分析方法驗證需進行的檢測項目和驗證指標，ICH Q2(R1）、ChP2020<9101>分析方法驗證指導原則和USP<1225>分析方法驗證通則都有明確的規(guī)定，如ChP2020<9101>分析方法驗證指導原則中規(guī)定根據(jù)檢驗項目的不同，視具體情況列出了驗證的指標，如專屬性、準確度、精密度（包括重復性、中間精密度和重現(xiàn)性）、檢測限、定量限、線性、范圍和耐用性。

 

1、檢測限和定量限

 

設備和檢測過程都存在誤差，實際上檢測結(jié)果是離散值，而非連續(xù)值。因此有必要去測試設備最小精度和可以測量準確的精度。

1）檢測限是指樣品中被測物能被檢測出的最低量。檢測限僅作為限度試驗指標和定性鑒別依據(jù)。定量限指被檢測物能被定量測定的最低量。

常用的測試方法有直觀法、信噪比法和線性法。

a）直觀法

用已知濃度的被測物，試驗出能被可靠地檢測出或定量出的最低濃度或量。

b）信噪比法

用于能顯示基線噪聲的分析方法，即把已知低濃度樣品檢測出或定量出的信號與空白樣品測出的信號比較，計算出能被可靠地檢測出或定量出的最低濃度或量。檢測限一般以信噪比3:1, 定量限為10:1.

c）線性法

 

δ有兩種測得方法：（1）測定空白樣品信號值的標準偏差；（2）標準曲線的剩余標準偏差或是截距的標準偏差。

基于線性的測量方法相對于信噪比法，避免了人為選擇噪音部分，同時考慮了多次進樣分析之間的差異，結(jié)果更為可靠。

2）可檢測性

USP PF39 <1200>中有提到用被測物的可檢測性來取代現(xiàn)有的驗證參數(shù)檢測限和定量限。

a: 配制一個在限度濃度的雜質(zhì)標準品溶液

b: 配置一個添加了在限度濃度的雜質(zhì)標準品的樣品標準品溶液

c: 配置一個添加了（限度100%-%RSD*濃度）的雜質(zhì)標準品的樣品標準品溶液

*由下圖1 Horwitz方程估算得出

如果a  b且c < 2, 測差異可被檢測出，否測該方法不能勝利限度的檢測。

圖1. Horwitz方程重復性和回收率變異度接收標準

3）統(tǒng)計學評價

“檢出”是指可判定被測試樣中存在待測物質(zhì)的濃度（或質(zhì)量）高于其空白值。由于測量值是以概率取值的隨機變量，測量值的分布具有統(tǒng)計性。因此樣品中檢出待測物質(zhì)的最小濃度是指在一定置信水平下判定樣品中存在待測物質(zhì)。

檢測限（LOD）估算是基于國際純粹與應用化學聯(lián)合會（IUPAC）和ISO的定義，引入了假陽性和假陰性決策。LOD的值依賴于實驗室能力。

首先定義一個臨界值Rc，該值為空白樣品在超過讀數(shù)，

等式中出現(xiàn)的a為第一類錯誤的概率（假陽性錯誤概率），b為第二類錯誤的概率（假陰性錯誤概率），如圖1:

響應值對應濃度值的回歸曲線為R = B+ mX,

 

R: 響應信號值；

 

B：空白平均讀數(shù)；

 

m: 回歸曲線斜率

 

X：被測樣品濃度值

二、線性

 

線性是指在實驗設計的范圍內(nèi)，試驗結(jié)果與樣品中被測物濃度之間的比例關系的能力。

方法驗證需要進行線性的考察，數(shù)據(jù)參數(shù)有回歸方程、相關系數(shù)、殘差平方和，線性圖等模型。線性關系是一種統(tǒng)計函數(shù)關系，是一種數(shù)理統(tǒng)計方法，使用到了最小二乘法進行了線性回歸計算。

1. 線性曲線的統(tǒng)計學評估

對于一般y隨x變化的線性關系表示為：

y=a+bx+ε

a為回歸線在縱坐標上的截距；

b為回歸線的斜率，表示y隨x變化所引起的變化率；

ε為實驗過程中其他隨機因素引起的隨機誤差。

線性關系的其他參數(shù)：

相關系數(shù)r為變量x與y間的相關性，一般來說r<0.3, 為弱相關；r>0.8為強相關；

剩余方差：指真實值y與理論值y間的差距。

方法1：回歸方程統(tǒng)計學評價

例1: 隨機得到一組數(shù)據(jù)，分別為濃度(X)和峰面積(Y)，如下表所示：

利用Excel 軟件，插入這一組數(shù)據(jù)的散點圖，添加趨勢線，對這兩組數(shù)據(jù)進行回歸分析計算，得到X與Y間的線性統(tǒng)計量：y =1.0291x - 0.2521, R² = 0.9984; X與Y之間的標準誤差使用 Excel軟件中的函數(shù)STEYX可以計算得到為0.1704。

上述數(shù)據(jù)對X與Y間的關系進行了簡單的分析與判斷，無法進行更多的統(tǒng)計學評價。

方法2:方差與置信區(qū)間的統(tǒng)計學分析

要進行兩者關系的方差分析與區(qū)間分析，可以利用EXCEL軟件中的宏文件分析工具，示意如下：

選擇EXCEL的數(shù)據(jù)分析®回歸，選擇對應的數(shù)據(jù)區(qū)域，勾選標志、置信度、殘差、標準殘差等參數(shù)，確認得到結(jié)果。

結(jié)果分析如下：

a. 回歸分析

結(jié)果表明，有99.8%的Y變異與X相關。濃度X的變化會引起峰面積99.8%的變化率。標準誤差表示在測試中有0.1704的噪音，它是由外界環(huán)境、人為等操作原因?qū)е碌摹Ｈ绻@個值較大，說明誤差較大，數(shù)據(jù)的準確度不高。

b.  方差分析：

Significance F<0.05, 說明模型在統(tǒng)計學上是顯著的，線性在統(tǒng)計學上是成立的。反之F>0.05, 則說明線性在統(tǒng)計學上不成立。

 

c. 置信區(qū)間：

Coefficients為線性系數(shù)a, b值。第一行為線性方程的截距，第二為線性方程的斜率。假如 ，則a= - 0.2520, b = 1.0291;

標準誤差表示為計算a, b時在實驗條件下的計算誤差；

P-value，第一行P>0.05, 表示b值過原點，標準誤差0.2149只是代表測量誤差。斜率p<0.05, 表示斜率有統(tǒng)計學意義。

95%置信區(qū)間，代表a, b的置信區(qū)間。該值可以用來判斷多次線性是否發(fā)生變化。如果置信區(qū)間不變，說明多次線性是一致。

 

d. 標準誤差分析：

標準誤差是指無法準確測試的那一部分數(shù)據(jù)，即噪音。標準殘差可以看作為標準誤差的觀測值。一般可以用標準誤差來估算定量限和檢測限。即10´標準誤差/斜率公式計算定量限，3´標準誤差/斜率計算檢測限。標準誤差還可以用來評估離群值。

當標準殘差絕對值大于2時，說明該測試點異常。

2. 兩條回曲線的比較

在分析實踐中，遇到同一臺儀器在不同時間，或不同人員用相同方法對同一測量對象測量得到兩條回歸直線不一定相同，包括兩條回歸直線的標準差不同，或斜率不同，或截距不同。那么如何判斷兩條回歸直線之間是否有顯著性差異，兩條回歸直線是否可以合并后計算測量結(jié)果。我們可以用F檢驗來判斷兩條回歸直線是否一致。

方差分析檢測兩回歸直線的方差是否有顯著性差異。

假設兩條回歸直線為：

y1=a1+b1x

y2=a2+b2x

 

用F檢驗檢查兩回歸線是否有顯著性差異，統(tǒng)計量為：

置信區(qū)間

將兩條回歸直線中的一條作為基準，通過方法2計算得到回歸直線的置信區(qū)間，如果另一回歸直線的截距和斜率都在基準回歸直線的置信區(qū)間內(nèi)，則認為兩回歸直線是一致的，則可以將兩條件直線擬合成一條直線。

 

三、結(jié)束語

本文討論了方法驗證中檢測限、定量限和線性的一些常見統(tǒng)計學指標及統(tǒng)計學評價方法。分析測量不確定度與分析方法密切相關，檢測限與定量限是衡量方法靈敏度的指標，線性是評估結(jié)果與樣品濃度的函數(shù)關系。

 

參考文獻

1. USP PF39(5) <1200>:Requirements for Compendial Validation

2. USP <1210>:Statistical Tools for Procedure Validation

3. USP <1225> Validationof Compendial Procedures

4. 中國藥典2020<9101>：分析方法驗證指導原則

5. USP <1010>: AnalyticalData - Interpretation and Treatment

6. 藥物雜質(zhì)分析，胡昌勤，2015

7. 分析測試統(tǒng)計方法和質(zhì)量控制，曹宏燕