中文字幕一级黄色A级片|免费特级毛片。性欧美日本|偷拍亚洲欧美1级片|成人黄色中文小说网|A级片视频在线观看|老司机网址在线观看|免费一级无码激情黄所|欧美三级片区精品网站999|日韩av超碰日本青青草成人|一区二区亚洲AV婷婷

本研究基于多層次仿生策略，優(yōu)化了半月板源性生物墨水的制備，使其兼顧可打印性和細(xì)胞相容性。另外設(shè)計(jì)了定制的打印系統(tǒng)，將人工材料和生物墨水的優(yōu)勢(shì)很好的結(jié)合，進(jìn)一步提高仿生水平。最后通過細(xì)胞活力、力學(xué)、生物降解和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)等，確保該支架具有足夠的可行性和功能性，為其在組織工程中的應(yīng)用提供可靠的依據(jù)。

 

01、研究內(nèi)容簡介

 

通過3D生物打印制備仿生支架是治療受損半月板的有效方法。然而，由于半月板獨(dú)特的解剖結(jié)構(gòu)和復(fù)雜的應(yīng)力環(huán)境，許多研究都采用了多種技術(shù)來充分利用不同的材料，如單純3D打印，或與灌注結(jié)合，或與靜電紡絲結(jié)合，來追求半月板的仿生，但這使得制備過程在一定程度上復(fù)雜化。一些研究人員試圖僅通過3D生物成像來解決這一挑戰(zhàn)，但打印材料和模型受到了明顯的限制。本研究中基于多層仿生策略，優(yōu)化了半月板源性生物墨水--甲基丙烯酸明膠(GelMA)/半月板細(xì)胞外基質(zhì)(MECM)的制備，同時(shí)考慮其打印性和細(xì)胞相容性。隨后，設(shè)計(jì)了一個(gè)定制的3 d生物打印系統(tǒng)--雙噴嘴+ 多重溫度系統(tǒng)，將聚已酸內(nèi)酯(PCL)和半月板纖維軟骨軟骨細(xì)胞(MFCs)嵌入的GelMA / MECM 生物墨水的優(yōu)勢(shì)很好的結(jié)合，完成了仿生半月板支架的打印。最后通過細(xì)胞活力、力學(xué)、生物降解和體內(nèi)組織形成等方面的研究，確保該支架具有足夠的可行性和功能性，為其在組織工程領(lǐng)域的應(yīng)用提供可靠的依據(jù)。

Fig 1. Process of printing the biomimetic meniscal scaffold. The bioink was prepared by mixing ultrasonicated MECM, GelMA and MFCs at specific concentrations. Meanwhile, the sheep meniscus was scanned by CT, modeled in Mimics, and used to plan the printing path. The prepared bioink and PCL were printed under the designed printing parameters according to the established printing path, and finally, printing of the biomimetic meniscal scaffold was completed.

 

仿生半月板支架的打印經(jīng)歷了一個(gè)復(fù)雜的過程（Fig 1）。良好的微環(huán)境有利于半月板組織的再生。因此制備兼顧可打印性和細(xì)胞相容性的生物墨水是十分關(guān)鍵的一步。當(dāng)前用于生物3D打印的生物墨水主要由天然聚合物組成，包括藻酸鈉，明膠，膠原蛋白，殼聚糖，纖維蛋白，透明質(zhì)酸和ECM等 。其中，ECM保留了大多數(shù)天然成分，去除了細(xì)胞免疫原性，是一種理想的生物材料。但是，由于ECM的成分復(fù)雜，不溶于水和有機(jī)溶劑，因此，難以打印。本研究開發(fā)了超聲的方法，將ECM顆粒粒徑減小且均一化，實(shí)現(xiàn)了ECM的可打印性。另外，該方法能夠有效的調(diào)控材料的粒徑并保證較小的破壞（Fig 2）。該研究還引入了明膠衍生物GelMA。兩種材料按照特定濃度混合制備了可打印性和細(xì)胞相容性兼顧的半月板來源生物墨水（Fig 3）。

Fig 2. Characterization of printable MECM. (a) Effect of ultrasonication time on the particle size of MECM. (b) Effect of treatment method on the particle size of MECM. (c) Quantitative distribution of the particle size. (d) Gross observation. (e) SEM images (scale bar: 1 μm). (f) Type I collagen immunofluorescence images (scale bar: 500 mm). (g) Quantitative analysis of the collagen concentration (**P < 0.01, ***P < 0.001).

Fig 3. Cytocompatibility of the meniscus-derived bioink. (a) CCK-8 assays results of MFCs cocultured with different hydrogels for 1-7 days. (b) Comparative gene expression analysis for chondrogenic SOX9, COL1A2 and COL2A1 in GelMA and GelMA/MECM at 14days. (c) Immunofluorescence images showing the chondrogenic phenotype of MFCs in GelMA and GelMA/MECM constructs by COL type I staining (Green), cell nuclei (DAPI, blue) and F-actin (Rhodamine-phalloidin, red) (scale bar: 500μm).

 

生物墨水的流變特性對(duì)于優(yōu)化打印參數(shù)至關(guān)重要。本研究充分表征了GelMA / MECM的流變學(xué)特性，發(fā)現(xiàn)該墨水具有良好的穩(wěn)定性和一定的溫敏性（Fig 4）。此外，這項(xiàng)研究表明，GelMA / MECM對(duì)溫度較不敏感，具有明顯的延遲性，需要超過30分鐘才能達(dá)到穩(wěn)定。由于在打印過程中組件之間的相互熱干擾，GelMA / MECM的粘彈性可能存在一些波動(dòng)，這些波動(dòng)可能會(huì)影響打印的平滑性和細(xì)胞的活力。因此，在這項(xiàng)研究中，選擇了電機(jī)驅(qū)動(dòng)打印而非氣動(dòng)驅(qū)動(dòng)打印。這樣即使GelMA / MECM由于溫度波動(dòng)而表現(xiàn)出一定的粘彈性變化，也不會(huì)明顯影響打印過程的平滑性。

Fig 4. Rheological characteristics and printability of the bioinks. (a-d) Rheological characteristics of the bioink: (a) Loss modulus (G’’) and storage modulus (G’) at different angular frequencies. (b) Variation in viscosity with varying shear rate at the gelation temperature. (c) Gelation kinetics from 15°C to 37°C. (d) Variations in loss modulus (G’’) and storage modulus (G’) from 37°C (T0) to a fixed temperature (T1, referring to legends). The above experiments were repeated in triplicate. GelMA/MECM’s transition of state from sol at 37°C (e) to gel at 20°C (f). (g) Printability of GelMA/MECM (scale bar: 1 cm). (h) GelMA/MECM hydrogel under a light microscope (scale bar: 1 mm). GelMA’s transition of state from sol at 37°C (i) to gel at 15°C (j). (k) Printability of GelMA (scale bar: 1 cm). (l) GelMA hydrogel under a light microscope (scale bar: 1 mm). (m) Spreading ratio of the bioinks (ns: P > 0.05).

 

多噴頭打印技術(shù)極大地?cái)U(kuò)展了可以選擇的材料范圍，這有利于構(gòu)建復(fù)雜的3D模型。但是，不同噴嘴和不同材料的配合仍然涉及許多細(xì)節(jié)。因此，探索每種材料的打印條件是必要的（Fig 5）。關(guān)于載有細(xì)胞的水凝膠的打印，生物墨水和細(xì)胞的類型均會(huì)對(duì)細(xì)胞活力造成一定的影響。在這項(xiàng)研究中，為確保高形狀保真度和細(xì)胞活力（大于90％），需要反復(fù)調(diào)整包括GelMA / MECM濃度比，噴嘴的內(nèi)徑，打印溫度和打印速度在內(nèi)的各種參數(shù)。PCL的打印相對(duì)簡單，要點(diǎn)僅包括打印溫度和速度。這項(xiàng)研究中的最大挑戰(zhàn)是如何很好地協(xié)調(diào)兩個(gè)噴嘴和材料，以同時(shí)兼顧結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，細(xì)胞活力和所需的機(jī)械性能等。經(jīng)過反復(fù)試驗(yàn)，最終確定以85°C為最佳PCL打印溫度，并根據(jù)凝膠動(dòng)力學(xué)確定了20°C的水凝膠打印溫度。打印平臺(tái)溫度為20°C也是重要的條件，有助于防止GelMA / MECM凝膠由于交聯(lián)前相對(duì)較高的室溫而轉(zhuǎn)變成溶液。否則，可能會(huì)破壞物質(zhì)交換孔隙的形成。實(shí)際上，要解決整個(gè)過程中的關(guān)鍵問題，需要對(duì)材料和打印原理有充分的了解，并且這樣的了解將有利于在不同領(lǐng)域中順利創(chuàng)建多種定制模型。

Fig 5. Development of the biomimetic meniscal scaffold system. The primary model(a-d): the gross observations (a) (scale bar:1 cm), the microscopic images (b) (scale bar: 1 cm) and SEM images (c, d) (scale bar: 500 um) of the hydrogel scaffold ("GelMA/MECM" hydrogel, abbreviated as "hydrogel" in subsequent experiments), PCL scaffold and simple square scaffold from left to right. (e) Process of printing the biomimetic meniscal scaffold. (f) Specific details of the meniscal model. (g) Actual diameter of the strands of the meniscal scaffold.

 

細(xì)胞活力和機(jī)械性能是用于驗(yàn)證該打印模型成功與否的初步標(biāo)準(zhǔn)。許多因素，包括生物墨水成分以及打印模型和參數(shù)，都會(huì)影響打印過程中的細(xì)胞活力。在本研究中，使用單噴嘴和雙噴嘴打印進(jìn)行細(xì)胞活力測(cè)試，然后在體外培養(yǎng)1天和14天。細(xì)胞活力超過90％（Fig 6）。此外，將水凝膠培養(yǎng)長達(dá)6周，細(xì)胞活力保持在90％以上。這些數(shù)據(jù)證明了該打印模型的可行性以及生物墨水的良好細(xì)胞相容性。

Fig 6. Cell viability after printing with a single nozzle (hydrogel+MFCs) and dual nozzles (PCL+hydrogel+MFCs). (a) Confocal images of two constructs after live-dead staining at two time points (scale bar: 500μm). The panoramic scanning (4×4) of the constructs printed by a single nozzle (b, black part was hole) and dualnozzles (c, black part was PCL) at 1 day (scale bar: 1mm). (d) Quantitative results for cell viability (*P < 0.05, ns: P > 0.05).

 

關(guān)于力學(xué)性能，本研究通過增加PCL單絲間距并減小PCL單絲直徑以實(shí)現(xiàn)更好的力學(xué)仿生。最終，PCL單絲直徑設(shè)置為500μm，間距設(shè)置為1000μm。支架的壓縮模量為12.63 MPa，高于人類半月板的壓縮模量（0.3–2 MPa）（Fig 7）。此外，受整體模型的限制，拉伸模量為24.86 MPa，在徑向方向上接近半月板的拉伸模量（4-20 MPa）。但是，與周向拉伸模量（78-120 MPa）相比，仍然存在一定差異。而這種差異只能通過開發(fā)更合適的材料去解決。

Fig 7. Mechanical properties of the scaffolds printed by single nozzle and dual-nozzle. (a) Compressive stress-strain curve. (b) Compressive Young's modulus (**P < 0.01). (c) Tensile stress-strain curve. (d) Tensile Young's modulus (**P < 0.01).

 

缺損組織再生和支架降解之間的匹配對(duì)于支架在組織工程領(lǐng)域的應(yīng)用十分重要。而本研究所用的材料在降解時(shí)間上存在一定的差異，因此研究者對(duì)不同的支架成分進(jìn)行了針對(duì)性的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。隨著熒光成像技術(shù)的發(fā)展，可以以無創(chuàng)方式在體內(nèi)連續(xù)監(jiān)測(cè)水凝膠的變化，為評(píng)估水凝膠的生物降解提供了一種有效而可靠的方法。因此，首先研究者將嵌入細(xì)胞的水凝膠支架培養(yǎng)長達(dá)八周，以驗(yàn)證其基本穩(wěn)定性。然后，在原位植入支架以評(píng)估PCL的生物降解，并在小鼠皮下植入Cy7標(biāo)記的支架以通過體內(nèi)成像監(jiān)測(cè)水凝膠的降解。結(jié)果表明，支架中水凝膠的生物降解需要大約一個(gè)月的時(shí)間（Fig 8）。關(guān)于支架的原位降解，一些支架在3個(gè)月時(shí)開始出現(xiàn)損傷，而在6個(gè)月時(shí)僅可見這些支架的殘骸。原因在分子量和納米壓痕測(cè)試的結(jié)果中（Fig 9）得到了很好的解釋。支架的分子量在3個(gè)月時(shí)沒有顯著降低，但在6個(gè)月時(shí)有一定的降低，納米壓痕的測(cè)試也呈現(xiàn)出了類似的結(jié)果。這表明最初的微環(huán)境可能對(duì)支架的完整性影響很小，但隨著時(shí)間的延長和分子量的降低，支架的強(qiáng)度逐漸減弱，從而大部分發(fā)生了降解。該結(jié)果表明，半月板的機(jī)械環(huán)境可能對(duì)支架的降解發(fā)揮了重要作用。

Fig 8. Quantitative fluorescence analysis of subcutaneous hydrogel degradation. (a) Variation in the fluorescence intensity of all specimens. The specimens in green circle cultured in PBS as control group. (b) Quantitative fluorescence analysis of three subcutaneous specimens from each group. (c) The process of surgical operation. (d) Dissection of the samples’ position after the fluorescence disappearance.

Fig 9. Analysis of the biodegradation of scaffolds in situ. (a) Gross view of the implant and femoral condyles (scale bar: 1 cm)，with the implants location shown in red circles . (b) Variation in the molecular weight of PCL. (c) Variation in the elastic modulus of PCL (****P < 0.0001). (d) Variation in the hardness of PCL (***P < 0.001). (e) Histological evaluation by collagen type I immunohistochemistry and picrosirius red (PR) and toluidine blue (TB) staining (scale bar: 500 mm).

 

裸鼠模型是觀察組織工程軟骨在體內(nèi)形成的主要方法。無胸腺裸鼠的免疫系統(tǒng)降低，允許異種細(xì)胞的植入。因此，在本研究中，嵌入細(xì)胞的支架被植入裸鼠皮下，以分析纖維軟骨組織的形成。結(jié)果表明，GelMA/MECM水凝膠和MFCs協(xié)助了類半月板組織的形成(Fig 10)。然而，由于裸鼠皮下微環(huán)境與人體半月板原生微環(huán)境存在明顯差異，該支架還需要在大型動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行驗(yàn)證。

Fig 10. Preliminary evaluation of the regenerative effect of scaffolds in a nude mouse model (scale bar: 500 mm).

 

總體來說，本研究通過一個(gè)定制的雙噴頭 + 多重溫控打印系統(tǒng)和半月板源性的生物墨水，充分集中了PCL和GelMA / MECM / MFCs的優(yōu)勢(shì)，實(shí)現(xiàn)類似于半月板的形態(tài)、力學(xué)、組分和微環(huán)境。并進(jìn)行了各種針對(duì)性的驗(yàn)證，以確保該支架在組織工程領(lǐng)域中應(yīng)用的可行性和有效性。然而，該支架在某些方面仍與天然半月板不同。PCL硬度高和柔韌性不足。MECM在脫細(xì)胞后失去其原始的物理性能，僅通過材料的逐層堆疊才能實(shí)現(xiàn)部分仿生，這與高度交聯(lián)的半月板膠原纖維的環(huán)狀排列不同。因此，材料科學(xué)和打印技術(shù)的改進(jìn)可能是推動(dòng)組織工程學(xué)發(fā)展的關(guān)鍵。當(dāng)前，不同技術(shù)的結(jié)合對(duì)于實(shí)現(xiàn)半月板的更高水平的仿生品可能是有效的。

 

02、論文第一/通訊作者簡介

 

第一作者

 

周建：碩士，中國人民解放軍總醫(yī)院第四臨床醫(yī)學(xué)中心骨科研究所，研究方向?yàn)?D生物打印，半月板組織工程。

 

田壯：碩士，中國人民解放軍總醫(yī)院第四臨床醫(yī)學(xué)中心骨科研究所，研究方向?yàn)?D生物打印，半月板組織工程。

 

通訊作者

 

郭全義：主任醫(yī)師/教授/博導(dǎo)，中國人民解放軍總醫(yī)院第四醫(yī)學(xué)中心骨科研究所負(fù)責(zé)人。“十二五、十三五、十四五”及科技部“863”生物醫(yī)藥領(lǐng)域組織工程關(guān)鍵技術(shù)與系列產(chǎn)品研發(fā)主題項(xiàng)目首席專家。首屆中華醫(yī)學(xué)會(huì)再生醫(yī)學(xué)分會(huì)副主任委員，中國醫(yī)藥技術(shù)協(xié)會(huì)骨組織庫分會(huì)副主任委員，針對(duì)骨關(guān)節(jié)炎、關(guān)節(jié)退變、關(guān)節(jié)軟骨損傷、股骨頭壞死、骨科腫瘤等影響人類健康，難以醫(yī)治的疾病進(jìn)行了科研和臨床研究，先后承擔(dān)和參加了國家自然基金面上項(xiàng)目、重點(diǎn)項(xiàng)目、國家科技部領(lǐng)域項(xiàng)目（領(lǐng)域首席科學(xué)家）、“863”課題、“973”項(xiàng)目、科技部支撐計(jì)劃、總后衛(wèi)生部重點(diǎn)課題等攻關(guān)工作。先后發(fā)表國內(nèi)外論文70余篇。多次參與可專業(yè)書籍的翻譯和編寫工作，在國際上首先把第四代組織工程軟骨應(yīng)用于關(guān)節(jié)軟骨損傷的修復(fù)，為早期關(guān)節(jié)軟骨損傷的患者帶來了福音，將很大程度避免由于軟骨損傷導(dǎo)致的關(guān)節(jié)置換手術(shù)。

 

唐佩福：主任醫(yī)師/教授/博導(dǎo)，中國人民解放軍總醫(yī)院骨科分院院長，創(chuàng)傷病區(qū)行政主任?，F(xiàn)任中國醫(yī)師協(xié)會(huì)骨科分會(huì)常委，華裔骨科學(xué)術(shù)委員會(huì)理事，骨與關(guān)節(jié)損傷學(xué)術(shù)委員會(huì)委員，全軍骨科學(xué)術(shù)委員會(huì)委員，中國致殘委員會(huì)常委，中國康復(fù)學(xué)術(shù)委員會(huì)常委，，《中華創(chuàng)傷雜志》通訊編委，《中華中西醫(yī)雜志》編委，《中華創(chuàng)傷骨科雜志》通訊編委，《實(shí)用骨科學(xué)》編委。曾獲得國家自然科學(xué)基金、北京市自然科學(xué)基金和軍隊(duì)十一五課題等多項(xiàng)基金資助。長期致力于創(chuàng)傷的臨床工作，并結(jié)合臨床進(jìn)行定向科研攻關(guān)，專業(yè)發(fā)展方向主要以骨質(zhì)疏松性骨折、骨折微創(chuàng)治療、髖臼骨折等治療為重點(diǎn)，同時(shí)在四肢創(chuàng)傷、戰(zhàn)傷救治、脊柱創(chuàng)傷、骨盆骨折、老年髖部損傷等領(lǐng)域進(jìn)行了一系列研究。近三年來，以第一作者發(fā)表論文14篇，《EI》收錄2篇。唐佩福教授長期致力于骨創(chuàng)傷與軟組織損傷修復(fù)方面的基礎(chǔ)研究及手術(shù)治療方法的改進(jìn)。在骨折治療的BO理念指導(dǎo)下，于國內(nèi)率先開展了骨折微創(chuàng)治療的系列研究。由于術(shù)中不開放骨折端，不剝離骨膜，軟組織損傷程度更小，因此充分保護(hù)了骨折局部的生物環(huán)境，是一種全新理念指導(dǎo)下的生物接骨術(shù)。此外，還開展了系列老年骨質(zhì)疏松癥的基礎(chǔ)研究，探討了調(diào)控成骨細(xì)胞與破骨細(xì)胞平衡的信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)，發(fā)現(xiàn)P57小體和PLAD域等重要的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和啟動(dòng)基因，對(duì)老年骨質(zhì)疏松癥的啟動(dòng)和進(jìn)展起到關(guān)鍵作用。

 

姚琦：主任醫(yī)師/教授/博導(dǎo)，國家公派哈佛大學(xué)麻省總醫(yī)院博士后，現(xiàn)任首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京世紀(jì)壇醫(yī)院骨關(guān)節(jié)科主任、中華醫(yī)學(xué)會(huì)創(chuàng)傷分會(huì)青年委員會(huì)副主任委員，中華醫(yī)學(xué)會(huì)北京骨科分會(huì)委員、中華醫(yī)學(xué)會(huì)骨科分會(huì)創(chuàng)傷學(xué)組委員。長期致力于創(chuàng)傷骨科的臨床工作，并結(jié)合臨床進(jìn)行科研攻關(guān)，專業(yè)發(fā)展方向主要以骨質(zhì)疏松骨折、骨折微創(chuàng)治療及骨科智能機(jī)器人為重點(diǎn)。首次利用原核表達(dá)系統(tǒng)成功制備出Sclerostin 蛋白，在獲得分泌抗sost 單克隆抗體基礎(chǔ)上, 利用RT-PCR 技術(shù)擴(kuò)增了抗體可變區(qū)基因VH和VL, 組裝成了單鏈抗體基因SOST-scFv, 并構(gòu)建單鏈抗體原核表達(dá)載體SOST-scFv-22b, 對(duì)表達(dá)蛋白的活性進(jìn)行初步研究, 為研究利用基因工程抗體治療骨質(zhì)疏松性疾病奠定基礎(chǔ)。先后主持科技部重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃、國家自然科學(xué)基金、北京市自然科學(xué)基金等多項(xiàng)課題；以第一作者和通訊作者發(fā)表SCI文章20余篇，中文核心期刊論文20余篇；獲得國家發(fā)明專利3項(xiàng)，參與編寫《坎貝爾骨科手術(shù)學(xué)》。

 

03、資助信息

 

該研究得到了國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（2017YFC1103404）國家自然科學(xué)基（81872070）等項(xiàng)目的支持。

 

04、原文信息

Jian Z, Zhuang T, Qinyu T, Liqing P, Kun L, Xujiang L, Diaodiao W, Zhen Y, Shuangpeng J, Xiang S, Jingxiang H, Shuyun L, Libo H, Peifu T, Qi Y, Quanyi G. 

3D bioprinting of a biomimetic meniscal scaffold for application in tissue engineering. 

Bioact Mater. 2020 Nov 30;6(6):1711-1726.