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本研究基于“蓮蓬”的特殊生物結(jié)構(gòu)，開發(fā)出內(nèi)部可生長(zhǎng)血管的3D打印支架促進(jìn)骨修復(fù)。利用微流控技術(shù)制備了負(fù)載去鐵胺(DFO)脂質(zhì)體的GelMA微球作為“蓮子”，并巧妙的與陶瓷支架——“外衣”進(jìn)行物理結(jié)合，成功構(gòu)建了內(nèi)部血管化的3D打印支架。該復(fù)合支架在體內(nèi)外具備出色的血管化和成骨能力，在骨修復(fù)領(lǐng)域有廣闊的應(yīng)用前景。

01、研究?jī)?nèi)容簡(jiǎn)介

骨組織是人體內(nèi)高度血管化和鈣化的系統(tǒng)，盡管具有自我再生能力，但因高能量創(chuàng)傷、嚴(yán)重的感染、骨腫瘤切除等原因?qū)е麓蠖喂侨睋p——缺損達(dá)到2cm以上，給社會(huì)和家庭帶來沉重的負(fù)擔(dān)。骨缺損內(nèi)部血供不足，進(jìn)而導(dǎo)致骨組織缺血、骨壞死和骨丟失，最終導(dǎo)致骨不連。組織工程在骨再生或替代中發(fā)揮了重要的作用，但如何在骨組織工程支架的內(nèi)部迅速有效地生成結(jié)構(gòu)良好的血管網(wǎng)，是多年來研究和臨床面臨的一大挑戰(zhàn)。3D打印支架，不僅完美解決了對(duì)于不同形態(tài)骨缺損模型的加工問題，還可以精確地控制材料的整體特性，準(zhǔn)確的模擬松質(zhì)骨的孔徑和孔隙率，被認(rèn)定為構(gòu)建仿生組織工程支架的有效手段。然而，3D打印支架內(nèi)部血管一直是困擾3D打印支架在骨修復(fù)領(lǐng)域的難題。

“蓮蓬”是埋藏蓮花雌蕊的海綿質(zhì)的花托，花托表面具有多數(shù)蜂窩狀孔洞,每一個(gè)孔洞內(nèi)生有1枚小堅(jiān)果即為“蓮子”,基于這種特殊的生物結(jié)構(gòu)及骨缺損修復(fù)過程中內(nèi)部血管化的啟發(fā)。近期，山東大學(xué)附屬濟(jì)南市中心醫(yī)院龔維明主任和上海交大醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院崔文國團(tuán)隊(duì)聯(lián)合通過3D打印構(gòu)建多孔生物陶瓷支架作為蓮蓬的“外衣”，利用脂質(zhì)體負(fù)載血管化藥物DFO，通過浸漬吸附的方式將DFO脂質(zhì)體與微流控水凝膠微球物理結(jié)合并作為“蓮子”，隨后將“蓮子”直接注射到3D打印支架內(nèi)部，從而構(gòu)建內(nèi)部血管化的“蓮蓬”生物陶瓷3D打印支架以促進(jìn)骨缺損的修復(fù)（Fig.1）。

Fig. 1. Schematic diagram of composite scaffold that incorporated GelMA microsphere @ Liposome (GML) into β - TCP scaffold (TGL) and its biological affects in bone repair process in rat bone defect model. (a) The unique biological structure of lotus seedpod and inspirational. (b) Construction process of TGL scaffolds. The synthesized GelMA were made into microspheres (GM) using microfluidics and the DFO loaded liposomes were assembled into the microspheres (GML) via physical adsorption. Finally, the GML was integrated to β-TCP through direct injection to construct the composite TGL. The bone repair capabilities of composite scaffolds were studied in rat distant femur defect model.

首先將制備好的GelMA微球進(jìn)行了光鏡和SEM的檢測(cè)，可以看到微球大小均一，表面成多孔狀。研究發(fā)現(xiàn)，與單純支架相比，復(fù)合支架填滿了微球，并且無論從孔隙率及力學(xué)強(qiáng)度上都與天然骨組織相匹配。體外釋放數(shù)據(jù)顯示，DFO在6小時(shí)內(nèi)快速釋放了36%，這有利于早期血管的侵入，而在隨后的7天中，DFO緩慢釋放69%，這對(duì)今后支架內(nèi)部血管網(wǎng)路的成熟和骨缺損的修復(fù)有積極的意義（Fig. 2）。

Fig. 2. Characterization of the scaffolds. (a) Light microscopic photos of GelMA microspheres (GM). (b) SEM images of GelMA Microspheres (GM). (c) Digital camera photos of Ca3(PO4)2 scaffold (β-TCP). (d) Fluorescent microscope images of GelMA Microsphere @ Liposome (GML). (e) SEM images of Liposome @ GelMA Microspheres (GML). (f) Digital camera photos of GML @ β-TCP (TGL). (g–h) Mechanical properties of β-TCP and TGL scaffold. (I) Porosity data of GM and GML (j) Characterization of liposome particles via DLS. (k) The in vitro release profile of DFO in the liposome.(i) The in vitro release profile of DFO in the TGL scaffolds. (T-test, NS, no significant difference.)

本研究通過體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了DFO有效促進(jìn)了人臍帶血內(nèi)皮細(xì)胞聚合成管狀，并通過RT-qPCR、Western-blot證實(shí)了DFO是通過激活Hif1-α通路， 上調(diào)VEGF的表達(dá)，來促進(jìn)新生血管生成的。（Fig. 3）。

Fig. 3. The vascularization studies of β - TCP and TGL scaffolds in vitro. (a) Endothelial network formation of HUVECs at 3 and 6 h after cell culture. (b–e) The differences of total length (b), number of junctions (c), number of meshes (d) and total meshes area per high power field (HPF) were analyzed. (All the above pictures were taken by laser scanning confocal microscope. Two-way ANOVA was used; ***, p < 0.001; ****, p < 0.0001) (f) The expression of Hif1-α and VEGF on β-TCP and TGL scaffolds (T-test, ***, p < 0.001). (g) The results of Western blot showed that HUVECs were cultured on the scaffold for 24 h. (h) Summarized data showing the difference of Hif1-α and VEGF expression of western-blot results.

該研究在體內(nèi)構(gòu)建大鼠遠(yuǎn)端股骨缺損的動(dòng)物模型，從Micro-CT及組織學(xué)兩個(gè)方向驗(yàn)證了支架在體內(nèi)的成骨效率。結(jié)果發(fā)現(xiàn)（Fig.4）,相對(duì)于空白組以及單純支架組，該復(fù)合支架通過釋放DFO，促進(jìn)支架內(nèi)部的血管化及骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）向成骨細(xì)胞分化，進(jìn)而顯著加快骨缺損的修復(fù)進(jìn)程。（Fig. 4）。

Fig. 4. Histological analysis of the new regenerated tissues in the defect area with the scaffold implantation. (a) Representative HE staining images indicating newly formed tissues including newly mineralized bone tissue (NB), fibrous tissue (F) primitive bone (PB) and scaffolds (S). (b) The quantification of new bone area in HE staining calculated by Image J software. (c) The LSCM scanning results of double calcein labelling at given time points (2 weeks and 4 weeks). The labeled calcein (green) and Alizarin Red S (red) were displayed. The panel in the left is enlarged to clearly show the double marker line. (d) The quantitative distance results of two marker lines was summarized. (e) Immunofluorescence staining of the decalcified bone slices, the angiogenesis and osteogenesis related genes Hif1-α, CD31, OPN and OCN significantly increased in the TGL group. (f) The expression difference of related proteins was quantified. (One-way ANOVA was used; *, p < 0.05; **, p < 0.01; ***, p < 0.001; ****, p < 0.0001); NS, no significant difference). (For interpretation of the references to colour in this figure legend, the reader is referred to the Web version of this article.)

因此，仿生“蓮蓬“的生物結(jié)構(gòu)，本研究開發(fā)出內(nèi)部血管化的3D打印支架。該研究證實(shí)了其優(yōu)越的材料學(xué)和生物學(xué)性能。由于該支架兼具內(nèi)部血管化及誘導(dǎo)BMSCs向成骨分化的潛能，促進(jìn)了3D打印支架的應(yīng)用潛力。期待這一領(lǐng)域的3D打印支架得到不斷開發(fā)和深入研究，以推動(dòng)3D打印支架促骨修復(fù)的快速發(fā)展。

02、論文第一/通訊作者簡(jiǎn)介

第一作者：韓曉宇

山東第一醫(yī)科大學(xué)附屬中心醫(yī)院，骨科，2018級(jí)碩士研究生，研究方向?yàn)樯锊牧辖閷?dǎo)的骨缺損的修復(fù)，上海市傷骨科研究所聯(lián)合培養(yǎng)。

第一作者：孫明杰

碩士，山東大學(xué)附屬濟(jì)南市中心醫(yī)院脊柱外科醫(yī)師，臨床從事原發(fā)性骨質(zhì)疏松，頸椎病及腰椎間盤突出的診療，主要研究方向?yàn)樯锊牧洗龠M(jìn)骨缺損的修復(fù)。

通訊作者：王鵬

博士，主治醫(yī)師，山東大學(xué)附屬濟(jì)南市中心醫(yī)院骨外科，脊柱外科。主要從事脊柱外科相關(guān)疾病的診治工作。任山東省醫(yī)學(xué)會(huì)骨科分會(huì)脊柱學(xué)組青年委員、腫瘤學(xué)組青年委員。山東省康復(fù)醫(yī)學(xué)會(huì)脊柱微創(chuàng)學(xué)組委員。濟(jì)南醫(yī)學(xué)會(huì)骨礦鹽與代謝疾病專業(yè)委員會(huì)委員、秘書。發(fā)表SCI論文5篇，主持山東省自然科學(xué)基金等項(xiàng)目2項(xiàng)，獲山東省科技進(jìn)步三等獎(jiǎng)。

通訊作者：龔維明

主任/教授/碩導(dǎo)，山東大學(xué)附屬濟(jì)南市中心醫(yī)院骨外科主任，脊柱外科主任。主要從事骨科及脊柱外科相關(guān)疾病的診治工作。任山東省醫(yī)學(xué)會(huì)骨科學(xué)分會(huì)委員，山東省康復(fù)醫(yī)學(xué)會(huì)骨科分會(huì)副主任委員，濟(jì)南醫(yī)學(xué)會(huì)骨礦鹽與代謝疾病專業(yè)委員會(huì)主任委員。發(fā)表SCI論文10余篇，主持多項(xiàng)省、市級(jí)科研項(xiàng)目，獲山東省科技進(jìn)步三等獎(jiǎng)。

通訊作者：崔文國

教授/博導(dǎo)，上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院/上海市傷骨科研究所。主要基于轉(zhuǎn)化生物醫(yī)用材料，從事骨、關(guān)節(jié)等組織修復(fù)重建的研究。以第一/通訊作者發(fā)表SCI論文120余篇（IF>10的40多篇），引用7000多次，H=45，專利40多項(xiàng)，主編Elsevier書籍1本、參編10本國際書籍章節(jié)。主持國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目重點(diǎn)項(xiàng)目、科技部重點(diǎn)研發(fā)項(xiàng)目、面上項(xiàng)目等各類課題10余項(xiàng)，獲國家級(jí)青年人才計(jì)劃等支持。曾參與獲得2018年教育部高等學(xué)?？茖W(xué)研究?jī)?yōu)秀成果獎(jiǎng)一等獎(jiǎng)等獎(jiǎng)項(xiàng)等。

03、資助信息

該研究得到了國家自然科學(xué)基金（51873107）等項(xiàng)目的支持。

04、原文信息

Xiaoyu Han1, Mingjie Sun1, Bo Chen , Qimanguli Saiding , Junyue Zhang , Hongliang Song , Lianfu Deng , Peng Wang*, Weiming Gong*, Wenguo Cui*, 

Lotus seedpod-inspired internal vascularized 3D printed scaffold for bone tissue repair. 

Bioactive Materials 6 (2021)1639-1652.