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高通量藥物篩選技術(shù)(High throughput screening，HTS)是20世紀(jì)80年代后期發(fā)展起來(lái)的一種用于新藥研發(fā)中的高新技術(shù)，它是在傳統(tǒng)的篩選技術(shù)基礎(chǔ)上，以分子水平和細(xì)胞水平的實(shí)驗(yàn)方法為基礎(chǔ)，以微板形式作為實(shí)驗(yàn)工具載體，以自動(dòng)化操作系統(tǒng)執(zhí)行實(shí)驗(yàn)過(guò)程，以靈敏快速的檢測(cè)儀器采集實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。以計(jì)算機(jī)對(duì)實(shí)驗(yàn)獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理，在同一時(shí)間內(nèi)對(duì)數(shù)以千、萬(wàn)計(jì)的樣品進(jìn)行檢測(cè)，并以相應(yīng)的數(shù)據(jù)庫(kù)支持整個(gè)技術(shù)體系的正常運(yùn)轉(zhuǎn)[1]。

 

高通量藥物篩選分析技術(shù)很多，可以分為熒光分析法、放射性法和化學(xué)發(fā)光法等[2]。熒光分析法的優(yōu)點(diǎn)包括價(jià)格相對(duì)便宜，無(wú)放射性標(biāo)記，安全性好，可重復(fù)性好及容易處理，特別是近年來(lái)熒光物質(zhì)的標(biāo)記技術(shù)和熒光檢測(cè)技術(shù)的突破性進(jìn)展使熒光分析法在HTS中的應(yīng)用日益廣泛。熒光分析法主要包括熒光強(qiáng)度分析法、熒光偏振法、熒光共振能量轉(zhuǎn)移法、熒光極化、熒光關(guān)聯(lián)光譜法?，F(xiàn)對(duì)前三種方法在先導(dǎo)化合物篩選的應(yīng)用實(shí)例進(jìn)行探析。

 

1、熒光強(qiáng)度分析

 

依據(jù)熒光強(qiáng)度的變化進(jìn)行檢測(cè)，如熒光生成檢測(cè)法中反應(yīng)后熒光強(qiáng)度增加；在熒光淬滅檢測(cè)法中，熒光強(qiáng)度減弱。該方法操作簡(jiǎn)便，適于微量化。

 

曹鴻鵬等[3]以中國(guó)分離的甲、乙型流感病毒制備神經(jīng)氨酸酶，以有熒光特性的化合物為酶反應(yīng)底物，建立了適合高通量篩選神經(jīng)氨酸酶抑制劑的熒光分析法。試驗(yàn)過(guò)程主要包括流感病毒神經(jīng)氨酸酶的制備，米氏常數(shù)Km值的測(cè)定，藥物對(duì)流感病毒神經(jīng)氨酸酶抑制劑的篩選?；衔颩UNANA是神經(jīng)氨酸酶的特異性底物，在神經(jīng)氨酸酶作用下產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物在355 nm 照射激發(fā)下，可以產(chǎn)生460 nm 熒光，熒光強(qiáng)度的變化，可以靈敏地反應(yīng)神經(jīng)氨酸酶活性。經(jīng)過(guò)一系列試驗(yàn)參數(shù)優(yōu)化，對(duì)1200個(gè)樣品進(jìn)行了篩選，有12個(gè)樣品對(duì)甲型流感病毒神經(jīng)氨酸酶活性產(chǎn)生較好的抑制作用和量效關(guān)系。

 

孫緬恩等[4]為了尋找作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)NOS的化合物，應(yīng)用熒光檢測(cè)方法建立了適用于高通量篩選的微量快速方法。生物體內(nèi)NOS催化產(chǎn)生NO的反應(yīng)需要NADPH作為輔助因子，在產(chǎn)生NO的同時(shí)伴隨著NADPH被轉(zhuǎn)化為NADP+，使反應(yīng)體系中NADPH濃度降低。NADPH在350nm波長(zhǎng)的激發(fā)光照射下，產(chǎn)生波長(zhǎng)為450 nm的熒光。反應(yīng)體系中熒光值的降低速率可以反映NADPH含量變化，因而可以間接反映NOS的活性。實(shí)驗(yàn)共篩樣品5600個(gè)。圖1是5600個(gè)樣品對(duì)NOS活性影響的統(tǒng)計(jì)結(jié)果，樣品活性表現(xiàn)為正態(tài)分布。

圖1、NOS為靶標(biāo)的樣品篩選結(jié)果[4]

在熒光強(qiáng)度高通量篩選方法中，需要測(cè)定總的熒光強(qiáng)度，篩選化合物的自身熒光和猝滅效應(yīng)可能會(huì)干擾測(cè)定結(jié)果，在最后的計(jì)算中可以作為異常數(shù)據(jù)除去，達(dá)到提高篩選精確性的目的。

 

2、熒光偏振法（FP）

 

任何熒光分子都可用其“吸收躍遷矩”MA 和“發(fā)射躍遷矩”ME 來(lái)描述。對(duì)于給定分子，其MA 和ME 分別有固定的取向。實(shí)驗(yàn)測(cè)得的發(fā)光強(qiáng)度分子正比于其吸收躍遷矩MA與偏振光取向(P)間夾角T的余弦平方，發(fā)射躍遷矩ME與檢偏器取向(A)夾角U的余弦平方[5]。偏振度是發(fā)射光強(qiáng)度的一個(gè)比值，無(wú)方向性，由分子大小決定。原理圖如下圖2。

圖2、藥物篩選熒光偏振原理圖1[6]

圖3、藥物篩選熒光偏振原理圖2[6]

設(shè)計(jì)藥物影響G蛋白偶聯(lián)受體超家族中跨膜受體介導(dǎo)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，分離足夠的GPCR，具有完整的構(gòu)象和可溶性形式的穩(wěn)定性以及合適的熒光配體的設(shè)計(jì)是提高FP效率和成功率的關(guān)鍵因素。近年來(lái)放射性配體結(jié)合試驗(yàn)逐漸被FP取代，用于發(fā)現(xiàn)GPCR的新型拮抗劑和激動(dòng)劑并確定它們的結(jié)合親和力，主要原因是實(shí)驗(yàn)成本降低和放射性的健康危害。GPCR的FP測(cè)定設(shè)置通常在熒光標(biāo)記的配體與其受體結(jié)合后增加FP值。在競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合FP測(cè)定中，未標(biāo)記的配體或相互作用的小分子抑制劑的存在導(dǎo)致標(biāo)記的配體分子的置換，從而增加它們的翻滾運(yùn)動(dòng)而這又可以被檢測(cè)為FP值的降低[6]。

 

薛妮娜等[7]在采用熒光偏振法建立HSP90抑制劑的高通量篩選模型中，以VER00051001為分子探針，依次變化HSP90α濃度和分子探針濃度，4 ℃孵育不同時(shí)間，檢測(cè)熒光偏振值，建立最終選用80 nM分子探針，2. 01μg/mLHSP90α蛋白的抑制劑熒光偏振篩選模型。最終結(jié)果顯示GA的IC50值為55 nM，NVP-AUY922的IC50值為13nM。具體結(jié)果如下圖4。

圖4、 GA和NVP-AUY922對(duì)HSP90α的親和抑制活性檢測(cè)[7]

 

3、熒光共振能量轉(zhuǎn)移法

 

FRET是指熒光供體受激發(fā)后不發(fā)射出光子而將激發(fā)的能量轉(zhuǎn)移到熒光受體的現(xiàn)象。產(chǎn)生FRET需要滿足3個(gè)條件：熒光供體和受體之間距離接近(1～10 nm)；供體的發(fā)射光譜與受體的激發(fā)光譜有重疊；供體和受體之間遷移偶極子的方向平行[8]。

 

Klink等在TKI篩選模型中應(yīng)用了TR-FRET檢測(cè)技術(shù)，其原理如下：將作為供體的稀土元素鋱(Tb，激發(fā)波長(zhǎng)為340 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為495 nm)與ADP單克隆抗體結(jié)合，作為受體的熒光素Alexa Fluor 633(發(fā)射波長(zhǎng)為520 nm)與ADP結(jié)合，體系中尚未發(fā)生酶促反應(yīng)時(shí)，Alexa Huor 633可借助ADP與ADP單克隆抗體的特異性結(jié)合與Tb接近，并發(fā)生FRET；當(dāng)酶促反應(yīng)發(fā)生時(shí)，PTK將ATP的磷酸根轉(zhuǎn)移到底物蛋白上，從而生成磷酸化底物和ADP，后者可與熒光素-ADP競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合ADP單克隆抗體，因此隨著反應(yīng)的進(jìn)行，Tb-ADP單克隆抗體與熒光素-ADP的結(jié)合減少，致使Tb與熒光素間的能量傳遞也逐漸減少，Alexa Huor 633發(fā)出的熒光強(qiáng)度降低；體系中供試化合物若具有PTK抑制作用，將會(huì)阻止酶促反應(yīng)進(jìn)行，導(dǎo)致Alexa Fluor 633發(fā)出的熒光強(qiáng)度不變或部分降低[9][10]。原理圖如下圖5。

圖5、TKI篩選模型中TR-FRET的應(yīng)用[9]

4、時(shí)間分辨熒光共振能量轉(zhuǎn)移法和熒光偏振法用于先導(dǎo)化合物篩選的比較實(shí)例

 

Nicolas Wyhs[11]等利用化合物文庫(kù)在篩選甲基化DNA和甲基-CpG結(jié)合域蛋白2（MBD2）結(jié)合的抑制劑過(guò)程中，分別采用了時(shí)間分辨熒光共振能量轉(zhuǎn)移法和熒光偏振法進(jìn)行了篩選前期模型優(yōu)化。原理圖如下圖6和7。

圖6、MBD2與DNA的結(jié)合的TR-FRET測(cè)定[11]

圖7、MBD2與DNA的結(jié)合的FT測(cè)定[11]

分別用兩種方法測(cè)定熒光標(biāo)記甲基化DNA和MBD2的相互作用，最終確定時(shí)間分辨熒光共振能量轉(zhuǎn)移的高通量篩選條件為30nM寡核苷酸和25nM MBD2，設(shè)定陽(yáng)性和陰性對(duì)照，最終熒光偏振法確定的高通量篩選條件為10nM寡核苷酸和200nM MBD2。實(shí)驗(yàn)具體結(jié)果如下圖8。

圖8、測(cè)定時(shí)間分辨熒光共振能量轉(zhuǎn)移（TR-FRET）和熒光偏振（FP）MBD2-MBD DNA結(jié)合測(cè)定的性能（A、B）。使用25nM標(biāo)記的底物寡核苷酸以384孔格式進(jìn)行對(duì)照處理的TR-FRET和FP測(cè)定的性能（C、D）[11]

 

泳道1（DMSO載體對(duì)照）和泳道3（過(guò)量未標(biāo)記未甲基化的DNA）是陰性抑制劑對(duì)照；泳道2是陽(yáng)性抑制劑對(duì)照，由過(guò)量的無(wú)熒光團(tuán)的甲基化DNA組成。泳道4是測(cè)定陰性對(duì)照，顯示缺乏與5'-熒光素標(biāo)記的未甲基化DNA的結(jié)合。相對(duì)于DMSO媒介物對(duì)照（泳道1）計(jì)算Z'因子[12]。結(jié)果顯示與熒光偏振測(cè)定（Z'因子= 0.08）相比，TR-FRET測(cè)定顯示出顯著更好的信噪比（Z'因子= 0.59）。如所預(yù)期的，陰性對(duì)照（高過(guò)量未標(biāo)記的未甲基化寡核苷酸）在任一測(cè)定中均未顯著破壞MBD和甲基化DNA的結(jié)合。選定TR-FRET進(jìn)行化合物庫(kù)1280個(gè)化合物的篩選和后期的劑量反應(yīng)曲線得到最終4個(gè)活性化合物[11]?；衔飵?kù)初步篩選結(jié)果如下圖9。

圖9、化合物文庫(kù)篩選圖[11]

 

總  結(jié)

 

目前，在新藥研發(fā)過(guò)程中，通過(guò)熒光檢測(cè)技術(shù)高通量篩選蛋白酶、蛋白激酶及其抑制劑、抗體等小分子已經(jīng)成為了研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。根據(jù)具體篩選的條件可以選用熒光技術(shù)的一種，同時(shí)還可以通過(guò)設(shè)定參照計(jì)算Z和Z'值來(lái)選取比較合適的熒光檢測(cè)方法。雖然熒光技術(shù)在HTS中的應(yīng)用還受到儀器裝置、篩選方法等條件的限制。但是熒光檢測(cè)不會(huì)像SPA（閃爍分析法）檢測(cè)產(chǎn)生放射性污染，也不需要像表面等離子共振法和核磁共振法需要特殊的儀器和設(shè)備以及沒(méi)有并行化不足問(wèn)題，操作安全度高，可操作性強(qiáng)，獲得研究機(jī)構(gòu)的認(rèn)可程度會(huì)越來(lái)越強(qiáng)。隨著新的熒光檢測(cè)技術(shù)不斷涌現(xiàn)，會(huì)有更多的新藥篩選模型應(yīng)用于實(shí)踐，新藥的研制周期可能會(huì)因此縮短。

 

 

參考文獻(xiàn)

1、杜冠華.創(chuàng)新藥物研究與高通量篩選[J].中國(guó)新藥雜志,2001,10(8):561

2、彭?yè)u鋼等.臨近閃爍分析法在高通量篩選中的應(yīng)用[J].化學(xué)進(jìn)展,2012,24(8):1572

3、曹鴻鵬等.流感病毒神經(jīng)氨酸酶抑制劑篩選模型的建立和應(yīng)用[J].藥學(xué)學(xué)報(bào),2002,37(12):930

4、孫緬恩等. 一氧化氮合酶抑制劑和增強(qiáng)劑的高通量篩選[J].藥學(xué)學(xué)報(bào),2002,37(3):161

5、PHOTOGRAPHIC SCIENCE AND PHOTO CHEMISTRY,1998,16(3):274

6、Expert Opin Drug Discovery. 2011,6(1): 17

7、薛妮娜等.采用熒光偏振法建立HSP90抑制劑的高通量篩選模型[J].中國(guó)生物化學(xué)雜志,2017,2(37):8

8、張怡軒,韓云波.熒光技術(shù)在高通量藥物篩選中的應(yīng)用[J].中國(guó)藥學(xué)雜志,2009,41(19):801

9、J Biomol Screen. 2008,13(6): 476

10、Progress in Pharmaceutical Sciences. 2012, 36(1):29

11、Journal of Biomolecular Screening.2014,19(7):1060

12、The Society for Biomolecular screening.1999,4(2):67