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原因一 、發(fā)送方和接收方實(shí)驗(yàn)室設(shè)置的不同

一個(gè)成功的方法轉(zhuǎn)移不僅取決于發(fā)送和接收雙方實(shí)驗(yàn)室在規(guī)范生物分析方面的經(jīng)驗(yàn)與知識(shí)，而且還取決于對(duì)被轉(zhuǎn)移方法特性的理解和溝通。兩個(gè)實(shí)驗(yàn)室在HPLC系統(tǒng)、質(zhì)譜、移液方法、自動(dòng)移液系統(tǒng)、試劑、試劑儲(chǔ)存、洗板器、玻璃管硅化方法、特殊設(shè)備的使用、漩渦混合器，甚至通風(fēng)櫥的氣流量等方面的微小不同，都可能導(dǎo)致方法轉(zhuǎn)移驗(yàn)證的失敗。因此，對(duì)于發(fā)送和接收雙方實(shí)驗(yàn)室而言，在方法轉(zhuǎn)移之前應(yīng)就方法的細(xì)節(jié)進(jìn)行清楚溝通，這至關(guān)重要。

原因二 、物質(zhì)的穩(wěn)定性原因

被分析物或其代謝產(chǎn)物的穩(wěn)定性也能影響樣品分析的重復(fù)性和準(zhǔn)確性。造成待測(cè)化合物或其代謝產(chǎn)物不穩(wěn)定的因素有許多，包括酶催化降解（如含酯藥物或者藥物前體）、化學(xué)反應(yīng)（如硫醇化合物）、兒茶酚類的自動(dòng)氧化、內(nèi)脂和羥基羧酸的互相轉(zhuǎn)化（如他汀類化合物）、氮氧化物的降解及Ⅱ相代謝產(chǎn)物降解、手性/差向異構(gòu)/互變異構(gòu)/同分異構(gòu)互相轉(zhuǎn)化等。在以上原因中，以Ⅱ相結(jié)合物（如?；咸烟侨┧幔┑拇x產(chǎn)物在樣品儲(chǔ)存、處理或色譜分析過(guò)程中降解為母體被測(cè)物的過(guò)程最為常見(jiàn)。不穩(wěn)定的Ⅱ相結(jié)合物的降解無(wú)疑會(huì)導(dǎo)致對(duì)母體化合物濃度的高估及已分析樣品在接收方實(shí)驗(yàn)室重新分析時(shí)明顯的正向偏差。復(fù)審被測(cè)物和代謝產(chǎn)物的穩(wěn)定性并測(cè)試相關(guān)穩(wěn)定性是至關(guān)重要的。如果被測(cè)物確實(shí)包含不穩(wěn)定的代謝產(chǎn)物，應(yīng)當(dāng)對(duì)液相色譜-質(zhì)譜（LC-MS）分析之前的樣品收集和處理有些額外的穩(wěn)定措施。任何發(fā)現(xiàn)都應(yīng)當(dāng)向接收方實(shí)驗(yàn)室交代清楚。

原因三 、不合適的方法選擇性

分析方法選擇性的評(píng)估應(yīng)當(dāng)用6組不同基質(zhì)配制的LLOQ濃度樣品。在這6個(gè)LLOQ濃度樣品中，5個(gè)分析結(jié)果的偏差值應(yīng)在標(biāo)示濃度的±20%內(nèi)。對(duì)于一些難以獲得的基質(zhì)，可以用少于6組的基質(zhì)來(lái)進(jìn)行選擇性測(cè)試；在轉(zhuǎn)移之前，甚至可用一組合并的基質(zhì)來(lái)進(jìn)行測(cè)試。測(cè)試單組基質(zhì)會(huì)掩蓋不同組基質(zhì)間的區(qū)別，這會(huì)在樣品分析選擇性不佳的情況下導(dǎo)致方法轉(zhuǎn)移的失敗。除一些常見(jiàn)的內(nèi)源性組分（如磷脂）外，已知或者未知的代謝產(chǎn)物，給量媒介，以及同時(shí)服用的藥物，都會(huì)導(dǎo)致分析選擇性的不足。

對(duì)分析物進(jìn)行色譜分離的主要依據(jù)是分析物和基質(zhì)組分相對(duì)于移動(dòng)相和HPLC柱上固定相的物理化學(xué)性質(zhì)的不同。當(dāng)質(zhì)譜在單反應(yīng)監(jiān)測(cè)或者多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM） 模式下工作時(shí)，干擾會(huì)比較少。大氣壓離子化技術(shù)[如電噴霧離子化（ESI）和大氣壓化學(xué)離子化（APCI）] 被普遍認(rèn)為是“軟性”的分析技術(shù)。然而，任何有弱鍵的分子都能夠在進(jìn)入串聯(lián)質(zhì)譜Q1室之前的電離過(guò)程中裂解（源內(nèi)裂解）。如果生物樣品提取物中存在分析物的氮氧化、硫氧化、葡萄糖醛酸或者硫酸共軛等代謝產(chǎn)物時(shí)，這一“源內(nèi)裂解”尤其明顯。這些代謝產(chǎn)物的源內(nèi)裂解可產(chǎn)生和母體化合物前體離子相同的離子。在高通量液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）分析中，色譜分離效果往往因?yàn)榇蟠罂s短的液相色譜分離時(shí)間而受到影響。如果發(fā)送方和接收方實(shí)驗(yàn)室的色譜條件有所不同，代謝產(chǎn)物的源內(nèi)裂解可能造成發(fā)送和接受方實(shí)驗(yàn)室測(cè)得的已測(cè)樣品濃度明顯不同。在這種情況下，常常需要在一方或雙方實(shí)驗(yàn)室對(duì)色譜方法進(jìn)行修改以便重新進(jìn)行方法驗(yàn)證。

原因四 、常見(jiàn)實(shí)驗(yàn)操作差錯(cuò)

對(duì)已測(cè)樣品再分析（IS R） 的失敗可能并不是由分析方法本身的問(wèn)題（選擇性或者穩(wěn)定性問(wèn)題）引起的，而是由實(shí)驗(yàn)操作的差錯(cuò)引起的。這些差錯(cuò)包括但不局限于：①樣品沒(méi)有充分融化，②在取樣之前樣品不均勻，③樣品稀釋不當(dāng)，④樣品標(biāo)識(shí)不清。鑒于此，應(yīng)該確保對(duì)實(shí)驗(yàn)室人員的正確訓(xùn)練。

方法轉(zhuǎn)移失敗的調(diào)查

對(duì)任何方法轉(zhuǎn)移的失敗，都應(yīng)進(jìn)行必要的調(diào)查。對(duì)此，發(fā)送方和接收方實(shí)驗(yàn)室必須有一個(gè)雙方認(rèn)可的書面程序（如方法轉(zhuǎn)移協(xié)議或者協(xié)議修正案）。

一般而言，調(diào)查會(huì)包括兩個(gè)階段：階段Ⅰ，對(duì)現(xiàn)存的數(shù)據(jù)和文件進(jìn)行審閱；階段Ⅱ，實(shí)驗(yàn)室調(diào)查，發(fā)送方和接收方實(shí)驗(yàn)室可能都需進(jìn)行。

Ⅰ

在階段Ⅰ的調(diào)查中，文件審閱應(yīng)當(dāng)集中在樣品標(biāo)識(shí)、準(zhǔn)備、數(shù)據(jù)處理、計(jì)算過(guò)程中的錯(cuò)誤，或者LC-MS系統(tǒng)中可能的錯(cuò)誤設(shè)置等方面。在結(jié)束階段Ⅰ的調(diào)查時(shí)，應(yīng)有以下3項(xiàng)可能的結(jié)果：

①找到了明確的原因，即確認(rèn)了方法轉(zhuǎn)移失敗的根本原因；

②找到了可能的原因，即方法轉(zhuǎn)移失敗的原因有可能被確認(rèn)，或者被縮小到幾個(gè)可能的原因；

③沒(méi)有找到明確的原因，即無(wú)法確認(rèn)直接的原因。

如果找到了可以歸咎的原因，應(yīng)馬上進(jìn)行改正。有時(shí)對(duì)數(shù)據(jù)處理和計(jì)算上的一個(gè)簡(jiǎn)單改正便可能結(jié)束調(diào)查。當(dāng)然，應(yīng)當(dāng)進(jìn)行必要的相關(guān)培訓(xùn)以防類似情況再次發(fā)生。

Ⅱ

在找到一個(gè)或者多個(gè)可能的實(shí)驗(yàn)室操作或者儀器錯(cuò)誤的情況下，應(yīng)當(dāng)進(jìn)行階段Ⅱ?qū)嶒?yàn)室調(diào)查，以確認(rèn)根本的原因。基于測(cè)試的結(jié)果，可以作出以下判斷：

①可歸咎的原因被確認(rèn)；

②沒(méi)有找到可以歸咎的原因。

對(duì)于前一點(diǎn)，應(yīng)馬上開(kāi)始多方面的工作，包括但不限于對(duì)樣品的重新分析。對(duì)于后者，應(yīng)當(dāng)進(jìn)行更深入的調(diào)查，如果可能，發(fā)送方實(shí)驗(yàn)室也應(yīng)進(jìn)行相應(yīng)的調(diào)查。在對(duì)方法進(jìn)行仔細(xì)審查時(shí)，應(yīng)當(dāng)評(píng)估以下因素的可能影響：不合適的樣品準(zhǔn)備，未知不穩(wěn)定代謝產(chǎn)物，分析物和內(nèi)源性化合物不理想的色譜分離，方法選擇性不理想等。應(yīng)當(dāng)進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)實(shí)驗(yàn)，以確認(rèn)可能的根本原因。這種調(diào)查可能導(dǎo)致一個(gè)簡(jiǎn)單的步驟修正和樣品重新分析，也可導(dǎo)致對(duì)生物分析方法的重新開(kāi)發(fā)和重新驗(yàn)證。

根據(jù)目的的不同，一個(gè)生物分析方法的轉(zhuǎn)移可能簡(jiǎn)單到單批次交叉驗(yàn)證，也可能是一個(gè)全面驗(yàn)證。在目前制藥行業(yè)將越來(lái)越多地將藥物后期研發(fā)工作外包給CRO（尤其是新興市場(chǎng)的CRO） 的趨勢(shì)下，方法全面驗(yàn)證可能成為必要。無(wú)論如何，方法轉(zhuǎn)移的結(jié)果都應(yīng)符合藥物監(jiān)管部門的要求。因此，發(fā)送方和接受方實(shí)驗(yàn)室都應(yīng)該協(xié)力合作。所有技術(shù)方面的挑戰(zhàn)都應(yīng)當(dāng)通過(guò)合適的渠道進(jìn)行討論，包括實(shí)地訪問(wèn)或培訓(xùn)。接受方實(shí)驗(yàn)室不應(yīng)懼怕質(zhì)疑方法的可轉(zhuǎn)移性。

最后，一個(gè)成功的方法轉(zhuǎn)移不但可以降低藥物開(kāi)發(fā)的成本，而且有助于雙方實(shí)驗(yàn)室建立長(zhǎng)期的合作關(guān)系，實(shí)現(xiàn)雙贏。