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牽張成骨是治療復(fù)雜骨缺損的有效方法，新骨形成及鈣化不良是該技術(shù)臨床應(yīng)用中亟待解決的問題。本研究將高純鎂棒作為髓內(nèi)導(dǎo)向器用于大鼠股骨牽張成骨模型，結(jié)果表明隨著高純鎂棒的逐漸降解，鎂離子可以有效地促進(jìn)新生骨鈣化。進(jìn)一步RNA-seq和生信分析發(fā)現(xiàn)該過程可能是通過鎂離子調(diào)節(jié)Ptch蛋白激活Hedgehog-alternative Wnt復(fù)合信號(hào)通路來實(shí)現(xiàn)的。

01、研究?jī)?nèi)容簡(jiǎn)介

骨缺損是由于創(chuàng)傷、感染、腫瘤、畸形等造成的常見結(jié)局，臨床治療非常困難。牽張成骨技術(shù)自上世紀(jì)60年代應(yīng)用于骨科臨床，取得了良好的臨床效果。牽張成骨技術(shù)通過給活體組織持續(xù)、穩(wěn)定的緩慢牽伸力，刺激或激活組織細(xì)胞的再生和活躍生長(zhǎng), 其生長(zhǎng)方式類似胎兒組織。牽張成骨技術(shù)目前應(yīng)用越來越廣泛，但一個(gè)共性問題是新骨形成鈣化緩慢、薄弱，以至于帶支架時(shí)間長(zhǎng)，再骨折、感染、關(guān)節(jié)僵硬等并發(fā)癥增多。這些都導(dǎo)致治療周期延長(zhǎng)，給患者的生活工作帶來了極大的不便，增加了經(jīng)濟(jì)和精神負(fù)擔(dān)，限制了牽張成骨技術(shù)的臨床應(yīng)用。因此，在牽張成骨過程中提高新骨形成和鈣化的速度，縮短帶架時(shí)間是臨床亟待解決的問題。

醫(yī)用可降解鎂金屬的成骨作用和機(jī)制研究是近年來的研究熱點(diǎn)。既往研究發(fā)現(xiàn)各種形式的鎂金屬在體內(nèi)外均有良好的成骨作用。鎂有良好的成骨效果，那么能否利用鎂來促進(jìn)牽張成骨新骨形成鈣化呢？由于牽張成骨是一種特殊狀態(tài)下的新骨形成和鈣化，鎂能否應(yīng)用于牽張成骨中，對(duì)于這種特殊狀態(tài)的新骨形成鈣化是否有促進(jìn)作用、其機(jī)制如何，之前國(guó)內(nèi)外仍是研究空白。課題組在近期研究中發(fā)現(xiàn)高純鎂棒可以通過VHL /HIF-1α/ VEGF信號(hào)通路促進(jìn)牽張成骨中新生血管生成達(dá)到促進(jìn)新生骨鈣化過程。

盡管在先前的研究中我們發(fā)現(xiàn)了高純鎂棒通過激活VHL /HIF-1α/ VEGF信號(hào)通路增強(qiáng)了牽張成骨新生骨鈣化，但其機(jī)制研究局限于血管生成，上游的機(jī)制仍不清楚。針對(duì)這一問題，課題組在之前的研究的基礎(chǔ)上進(jìn)行了鎂對(duì)于牽張成骨作用及機(jī)制的一系列研究。在本研究中課題組將高純鎂棒作為髓內(nèi)導(dǎo)向器用于大鼠股骨牽張成骨模型，用不銹鋼組和空白組作為對(duì)照（Fig.1）。

Fig.1. a: The grouping of rat femur DO model. b: Timeline for distraction protocol.

我們對(duì)術(shù)后第3、6、9周組織進(jìn)行X線片、micro-CT檢測(cè)觀察，發(fā)現(xiàn)高純鎂組顯著加快成骨鈣化速度（Fig.2）。

Fig.2. Hp Mg accelerated bone consolidation during distraction osteogenesis in rats. a:X-ray images of the distraction regenerate at 3,5,7 and 9 weeks after distraction. b: Representative 3D micro-CT images of the distraction zone after surgery 3,6 and 9 weeks. c, d, e: Quantitative analysis of micro-CT data showed higher values of BMD,  BV/TV and Tb.Th in the Hp Mg group at consolidation phase (**p < 0.01).

相應(yīng)的組織學(xué)觀察也顯示在術(shù)后第9周高純鎂組已基本完成鈣化過程，明顯優(yōu)于不銹鋼組和空白組（Fig3f,g）。力學(xué)檢測(cè)進(jìn)一步顯示出高純鎂組有更好的力學(xué)性能（Fig3d,e）。這些結(jié)果都表明，在牽張的同時(shí)，隨著高純鎂棒的逐漸降解，可以有效地促進(jìn)新生骨成骨鈣化。

Fig.3. a: In vivo 3D micro-CT images of the Hp Mg and SS pins. b: Volume change of intramedullary Hp Mg pins. c: Bone volume surrounding Hp Mg and SS pins (**p < 0.01). d, e: Mechanical tests (ultimate load and energy to failure) of the distracted femur. The values were normalized to the corresponding contralateral normal femur (**p < 0.01). f:H&E staining Hp Mg group enhanced bone consolidation in comparison with the SS and control group. g: In Saffron solid green, at 6 and 9weeks chondrocytes cartilage were evident in the SS and control groups compared to the Hp Mg group.

鎂對(duì)于牽張新生骨的形成鈣化的促進(jìn)機(jī)制是什么？是否與前期研究的VHL /HIF-1α/ VEGF信號(hào)通路有關(guān)呢？為此，課題組于鈣化中期取新生骨組織進(jìn)行高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（RNA-seq），與不銹鋼組和空白組比較得到差異表達(dá)基因，并對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行了KEGG通路富集分析。KEGG通路富集結(jié)果顯示，Wnt通路在所有通路中排名第二并且在成骨相關(guān)通路中富集最明顯。VHL /HIF-1α/ VEGF信號(hào)通路雖然也有富集，但排名比較靠后（Fig.4）。該研究結(jié)果首次揭示了鎂促進(jìn)牽張成骨的主要信號(hào)通路與Wnt通路相關(guān)。

Fig.4. a: Summary of DEGs. Red color represents up-regulated DEGs. Blue color represents down-regulated DEGs. b, c, d: Volcano plot. Red points represent up-regulated DEGs. Blue points represent down-regulated DEGs. Gray points represent non-DEGs. e: Venn diagram of DEGs. f: Bubble chart showing top 20 enriched pathways in the KEGG.

進(jìn)一步對(duì)于Wnt通路關(guān)鍵基因研究中，課題組發(fā)現(xiàn)經(jīng)典Wnt 通路的Wnt 分子及其下游的β-catenin未差異表達(dá)，而近期研究發(fā)現(xiàn)的Alternative Wnt信號(hào)通路完全被激活。2015年P(guān)ark HW等在Cell上發(fā)表的研究顯示：Alternative Wnt信號(hào)通路通過Wnt5b蛋白刺激膜蛋白Fzd，進(jìn)一步激活YAP/TAZ并入核促進(jìn)核內(nèi)TEAD高表達(dá)，從而促進(jìn)Runx2等成骨基因表達(dá)而促進(jìn)成骨。我們針對(duì)Wnt通路關(guān)鍵基因進(jìn)行了qPCR、WesternBlot和免疫組化驗(yàn)證。結(jié)果驗(yàn)證高純鎂通過Alternative Wnt通路，而不是經(jīng)典Wnt通路，促進(jìn)牽張成骨鈣化。

Wnt5b作為激活A(yù)lternative Wnt通路的上游配體，在骨生長(zhǎng)及骨折愈合過程中有重要作用，尤其在軟骨內(nèi)成骨中有重要作用。我們前期研究也發(fā)現(xiàn)Wnt5b有高表達(dá)。因此，針對(duì)Wnt5b我們通過生物信息學(xué)進(jìn)一步探索上游基因并與前期RNA-Seq結(jié)果比對(duì)，發(fā)現(xiàn)其上游基因中Gli1和Gli2有高表達(dá)（Fig.5a）。Gli1和Gli2都是Hedgehog通路的關(guān)鍵核轉(zhuǎn)錄因子。Hedgehog信號(hào)通路是一條保守且重要的信號(hào)通路，參與體內(nèi)多種生物代謝過程中。研究顯示Hedgehog信號(hào)通路參與骨形成，代謝以及骨折愈合等代謝過程，抑制Hedgehog通路會(huì)導(dǎo)致骨折不愈合或延遲愈合。當(dāng)存在Hedgehog蛋白時(shí)，Hedgehog蛋白與Patched（Ptch）受體結(jié)合，阻斷Ptch對(duì)Smoothed（Smo）受體的抑制，促使Smo受體發(fā)生磷酸化修飾，活化的Smo受體抑制PKA的活性，從而抑制了對(duì)Gli蛋白的裂解，使核轉(zhuǎn)錄因子Gli家族蛋白完整的在核內(nèi)發(fā)揮作用促進(jìn)成骨鈣化基因表達(dá)，其中Gli1 和Gli2在蛋白水平作用相似, 均可以促進(jìn)Wnt5b表達(dá)（Fig.5b）。因此，我們針對(duì)Hedgehog通路關(guān)鍵基因進(jìn)行了qPCR、WesternBlot和免疫組化驗(yàn)證。結(jié)果驗(yàn)證高純鎂通過Hedgehog-Alternative Wnt通路促進(jìn)牽張成骨鈣化。

Fig.5.a: Wnt5b gene radar analysis. b: RNA-seq results enrichment map of Hedgehog pathway.

針對(duì)這些Hedgehog通路上游基因我們比對(duì)了RNA Seq結(jié)果并做了進(jìn)一步的qPCR及Western Blot驗(yàn)證。結(jié)果發(fā)現(xiàn)膜表面受體Smo，Ptch均有高表達(dá)，而三種Hedgehog蛋白基因均未高表達(dá)（Fig.5b）。關(guān)于膜蛋白Ptch的研究中，Hitzenberger M等通過分子動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，Ca2+、Zn2+作為二價(jià)金屬離子在Hedgehog蛋白調(diào)控Ptch過程中發(fā)揮了重要作用。因此可以假設(shè)同樣作為二價(jià)金屬離子的鎂離子通過某種機(jī)制取代Hedgehog蛋白的二價(jià)金屬離子結(jié)構(gòu)與Ptch結(jié)合，改變其蛋白構(gòu)象和功能，減少對(duì)Smo的抑制，進(jìn)一步激活Hedgehog通路。因此，我們以鈉離子作為對(duì)照通過分子動(dòng)力學(xué)模擬鎂離子對(duì)Ptch蛋白構(gòu)象變化。結(jié)果顯示結(jié)果表明，Mg2 +與Ptch蛋白表面的酸性氨基酸殘基Glu592，Asp803和Asp804形成配位鍵，從而穩(wěn)定了562-595和794-803區(qū)的結(jié)構(gòu)。鎂離子與其他酸性殘基Glu191，Glu188，Glu205，Asp782，Asp361，Asp105和Asp787形成配位鍵，這在穩(wěn)定Ptch蛋白結(jié)構(gòu)中也起著重要作用（Fig.6a）。

至此，結(jié)合全部前期試驗(yàn)結(jié)果，我們提出鎂促進(jìn)牽張成骨新生骨的成骨鈣化作用的機(jī)制假說。其可能的機(jī)制是：鎂通過調(diào)控膜受體Ptch，減少對(duì)膜受體Smo的抑制作用，進(jìn)而激活Hedgehog通路，而該通路的Gli1和Gli2轉(zhuǎn)錄表達(dá)Wnt5b激活A(yù)lternative Wnt通路，通過YAP/TAZ蛋白轉(zhuǎn)錄生成Runx2等成骨相關(guān)蛋白表達(dá)，從而促進(jìn)牽張成骨中新生骨的成骨鈣化（Fig.6b）。通過上述實(shí)驗(yàn)，我們明確鎂在牽張成骨過程中促進(jìn)成骨鈣化的具體調(diào)控機(jī)制，為醫(yī)用可降解鎂金屬髓內(nèi)導(dǎo)向這一創(chuàng)新方法克服臨床上牽張成骨關(guān)鍵難點(diǎn)提供理論依據(jù)。

Fig.6. a: Molecular dynamics simulation results. Mg2+ forms a coordination bond with Glu592, Asp803, Asp804, Glu191, Glu188, Glu205, Asp782, Asp361, Asp105, and Asp787. b: Schematic diagram showing diffusion of implant-derived Mg2+ enhances bone consolidation in distraction osteogenesis via regulating Ptch protein activating Hedgehog-alternative Wnt signaling.

02、通訊作者簡(jiǎn)介

第一作者：木沙·哈木山

上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院，骨科，2020級(jí)博士研究生，研究方向?yàn)殒V基材料在骨科應(yīng)用以及骨關(guān)節(jié)感染免疫機(jī)制。

通訊作者：韓培

上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院，骨科，主任醫(yī)師，博士，碩導(dǎo)。長(zhǎng)期從事創(chuàng)傷骨科與修復(fù)重建外科的臨床工作，作為組長(zhǎng)負(fù)責(zé)骨關(guān)節(jié)與軟組織感染專業(yè)組臨床工作，作為Co-PI共同負(fù)責(zé)骨研所骨內(nèi)植物感染實(shí)驗(yàn)平臺(tái)科研工作。主要研究方向生物醫(yī)用鎂金屬材料的醫(yī)工交叉研究，骨關(guān)節(jié)感染的臨床基礎(chǔ)研究。主持國(guó)家、省部級(jí)課題5項(xiàng)，先后以第一作者／共同第一作者／通訊作者在Biomaterials、Acta Biomaterialia等雜志發(fā)表SCI論文近20篇。研究獲得上海市科技進(jìn)步一等獎(jiǎng)和華夏醫(yī)學(xué)科技進(jìn)步一等獎(jiǎng)。

沈?yàn)?/span>

上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院，骨科，主任醫(yī)師，博士，博導(dǎo)，上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院骨科副主任，上海市四肢顯微研究所骨關(guān)節(jié)內(nèi)植物感染實(shí)驗(yàn)平臺(tái)負(fù)責(zé)人。長(zhǎng)期從事關(guān)節(jié)外科的臨床和研究工作。主要從事關(guān)節(jié)置換和骨科感染的臨床和基礎(chǔ)研究，骨科內(nèi)植物感染的發(fā)病機(jī)制和抗菌生物材料的研發(fā)和轉(zhuǎn)化研究。主持國(guó)家級(jí)及省部級(jí)課題5項(xiàng)，完成2次成果鑒定，多次獲得國(guó)家級(jí)及省部級(jí)醫(yī)學(xué)科技獎(jiǎng)勵(lì)。先后以第一作者／共同第一作者／通訊作者在ACS Nano、Acta Biomaterialia、The Journal of infection等雜志發(fā)表SCI論文近50余篇，主編和參編專著8部。

張小農(nóng)

上海交通大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院博士生導(dǎo)師，主持和參加國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)專項(xiàng)、國(guó)家“863”高技術(shù)計(jì)劃、國(guó)家自然科學(xué)基金、上海市納米專項(xiàng)基金等科研項(xiàng)目30余項(xiàng)，發(fā)表學(xué)術(shù)論文150多篇（其中2篇論文入選ESI高被引論文），參編著作3部，授權(quán)發(fā)明專利20多項(xiàng)，獲得國(guó)家自然科學(xué)二等獎(jiǎng) 、上海市科技進(jìn)步一等獎(jiǎng)和二等獎(jiǎng)各一次。

03、資助信息

該研究得到了國(guó)家自然科學(xué)基金（81974325，81702183）和上海市科委基金（18ZR1428700， 19441903000）等項(xiàng)目的支持。

04、原文信息

Musha Hamushan #, Weijie Cai , Yubo Zhang, Zun Ren, Jiafei Du, Shaoxiang Zhang, Changli Zhao, Pengfei Cheng, Xiaonong Zhang*, Hao Shen*, Pei Han *

High-purity magnesium pin enhances bone consolidation in distraction osteogenesis via regulating Ptch protein activating Hedgehog-alternative Wnt signaling. 

Bioactive Materials 2020;6(6):1563-1574