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液質(zhì)聯(lián)用在醫(yī)藥、生物、食品、環(huán)境等領(lǐng)域都有著廣泛的應(yīng)用，是檢測(cè)小伙伴們都很熟悉的一個(gè)檢測(cè)儀器，但是在使用過(guò)程中很多小伙伴也都會(huì)因?yàn)橐恍﹩?wèn)題而頭疼，看看下面這些問(wèn)題你平時(shí)遇到過(guò)嗎？該怎么解決呢？！

原理、分類、特點(diǎn)

 

LC-MS原理概述

液質(zhì)聯(lián)用原理與氣質(zhì)聯(lián)用類似，它以液相色譜作為分離系統(tǒng)，質(zhì)譜為檢測(cè)系統(tǒng)。樣品在質(zhì)譜部分和流動(dòng)相分離，被離子化后， 經(jīng)質(zhì)譜的質(zhì)量分析器將離子碎片按荷質(zhì)比分開，經(jīng)檢測(cè)器得到質(zhì)譜圖。

 

體現(xiàn)了色譜和質(zhì)譜優(yōu)勢(shì)的互補(bǔ)，將色譜對(duì)復(fù)雜樣品的高分離能力，與MS具有高選擇性、高靈敏度及能夠提供相對(duì)分子質(zhì)量與結(jié)構(gòu)信息的優(yōu)點(diǎn)結(jié)合起來(lái)，在藥物分析、食品分析和環(huán)境分析等許多領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用。

 

常用的兩大分類系統(tǒng)：

一種是從質(zhì)譜的離子源角度來(lái)劃分，包括電噴霧離子源(ESI)，大氣壓化學(xué)電離源(APCI)，大氣壓光電離源(APPI)和基質(zhì)輔助激光解吸電離源(MALDI)等;

 

另一種是從質(zhì)譜的質(zhì)量分析器角度來(lái)劃分，包括四極桿、離子阱、飛行時(shí)間(TOF)和傅立葉變換質(zhì)譜等。ESI、APCI和APPI三種離子源大多與四極桿和離子阱質(zhì)譜聯(lián)用，是目前應(yīng)用最廣泛的幾種液質(zhì)聯(lián)用儀。

 

主要分析特點(diǎn)：

LC-MS除了可以分析氣相色譜一質(zhì)譜((GC-MS)所不能分析的強(qiáng)極性、難揮發(fā)、熱不穩(wěn)定性的化合物之外，還具有以下幾個(gè)方面的優(yōu)點(diǎn)：

 

分析范圍廣，MS幾乎可以檢測(cè)所有的化合物，比較容易地解決了分析熱不穩(wěn)定化合物的難題;

 

分離能力強(qiáng)，即使被分析混合物在色譜上沒有完全分離開，但通過(guò)MS的特征離子質(zhì)量色譜圖也能分別給出它們各自的色譜圖來(lái)進(jìn)行定性定量;

 

定性分析結(jié)果可靠，可以同時(shí)給出每一個(gè)組分的分子量和豐富的結(jié)構(gòu)信息;

 

檢測(cè)限低，MS具備高靈敏度，通過(guò)選擇離子(SIM)檢測(cè)方式，其檢測(cè)能力還可以提高一個(gè)數(shù)量級(jí)以上;

 

分析時(shí)間快，LC-MS使用的液相色譜柱為窄徑柱，縮短了分析時(shí)間，提高了分離效果;

自動(dòng)化程度高，LC-MS具有高度的自動(dòng)化。

 

保養(yǎng)維護(hù)

 

1、使用的穩(wěn)壓電源UPS，保證儀器電源電壓穩(wěn)定持續(xù)(特別是停電時(shí)對(duì)儀器的影響)。

2、每天用異丙醇溶液沖洗系統(tǒng)和清潔霧化室，定期開震氣閥震氣(對(duì)于ESI源，至少每星期做一次;對(duì)于APCI源，每天做一次)，保證毛細(xì)管潔凈。

3、流動(dòng)相流速不要過(guò)高，ESI離子源不要超過(guò)0.5ml/min，APCI不要超過(guò)1.0ml/min。

4、一年或者半年更換真空泵油。

5、控制好樣品運(yùn)行的環(huán)境，包括溫度和濕度。

6、實(shí)驗(yàn)完畢后要清洗進(jìn)樣針、進(jìn)樣閥等，用過(guò)含酸的流動(dòng)相后，色譜柱和離子源都要用甲醇/水沖洗。

7、定期清洗樣品錐孔，關(guān)閉隔斷閥，取下樣品錐孔，先用甲醇：水：甲酸(45：45：10)的溶液超聲清洗10分鐘，然后在分別用超純水和甲醇各溶液超聲清洗10分鐘，待晾干后再安裝到儀器上。

8、流動(dòng)相要現(xiàn)用現(xiàn)配，最好不要過(guò)夜，一定要新鮮。

9、定期更換電子倍增器。

 

常見故障

 

1、基線有雜峰，且難以消除

可能的原因：LC-MS被污染了

故障排除及解決方案：

a：雜質(zhì)離子大部分來(lái)自于流動(dòng)相，任何廠家、任何純度的試劑都可能帶有雜質(zhì)離子，因此可以考慮用不同批次、不同品牌的試劑作為流動(dòng)相進(jìn)行排除。另外，在使用過(guò)程中，流動(dòng)相不能使用多天，需要定期更換。

b：出口閥、液相管路等中殘留雜質(zhì)，可以不接色譜柱，使用不高于60℃的純水或有機(jī)溶劑依次Purge每個(gè)通道，然后沖洗整個(gè)系統(tǒng)，對(duì)出口閥和管路中可能存在的鹽等雜質(zhì)具有較好的沖洗效果。

c：內(nèi)部濾芯使用一段時(shí)間后容易受到污染，因此可以嘗試更換LC和MS系統(tǒng)的在線過(guò)濾器濾芯，以及清洗ESI離子源，更滑ESI霧化器噴針。

 

2、靈敏度下降

可能的原因：

方法建立不準(zhǔn)確，流動(dòng)相和樣品存在差異，流動(dòng)相變質(zhì)等

 

故障排除及解決方案：

a：確定故障側(cè)。液質(zhì)系統(tǒng)一般會(huì)配備紫外檢測(cè)器，將LC連接紫外部分做檢測(cè)，若UV檢測(cè)結(jié)果正常，則問(wèn)題一般在MS側(cè)；如UV檢測(cè)結(jié)果中未明確顯示峰值，則問(wèn)題應(yīng)在LC側(cè)。LC側(cè)影響靈敏度的主要是流動(dòng)相污染或改變，以及樣品進(jìn)樣量。樣品注射器有氣泡、進(jìn)樣針堵、液相管路有漏液都會(huì)影響靈敏度。

b：性能檢測(cè)。流動(dòng)注射標(biāo)準(zhǔn)品（即標(biāo)準(zhǔn)性能檢查溶液）進(jìn)質(zhì)譜，檢查質(zhì)譜峰的峰高、半峰寬、峰位置。性能檢查能快速確定質(zhì)譜儀是否存在峰響應(yīng)強(qiáng)度、分辨率或質(zhì)量準(zhǔn)確度方面的問(wèn)題。峰強(qiáng)下降可能跟離子源污染、毛細(xì)管污染或堵塞、質(zhì)譜真空度不夠有關(guān)。分辨率設(shè)置過(guò)高，質(zhì)量數(shù)漂移會(huì)影響目標(biāo)質(zhì)量離子檢測(cè)強(qiáng)度。

c：質(zhì)譜離子源。質(zhì)譜離子源是最易污染的區(qū)域，大量的或過(guò)濃的樣品分析，會(huì)導(dǎo)致在錐孔處污染物的堆積和離子源通道離子轟擊的沉積物留痕，結(jié)果均會(huì)造成離子傳輸效率下降，從而儀器靈敏度下降，因此必須定期清洗離子源，慮到污染的可能性順序，清洗順序依次是一級(jí)錐孔及錐孔套、離子源塊、離子透鏡。

 

3、無(wú)峰

保證毛細(xì)管電壓正常；保證LC/MSD檢測(cè)器壓力值在正常范圍；保證LC/MSD調(diào)諧正常；檢查干燥氣流量和溫度是否正常。

 

4、信號(hào)低

檢查溶液化學(xué)性質(zhì)，確定溶劑是否合適；保證LC/MSD調(diào)諧正常；檢查霧化器條件；檢查毛細(xì)管有無(wú)污染和損壞。

 

5、霧化器出口是小液滴而不是噴霧

檢查霧化器中針頭的位置；確保霧化氣壓的設(shè)定足夠高以氣化流動(dòng)相；檢查霧化器末端是否損壞。

 

6、高質(zhì)譜噪音

檢查霧化器是否損壞或放置是否得當(dāng)；保證干燥用氣流和溫度對(duì)溶劑流動(dòng)是正確的；保證溶劑徹底脫氣；保證LC反壓穩(wěn)定。

 

常見雷區(qū)

 

雷區(qū)一

酸性物質(zhì)適合做負(fù)離子檢測(cè)，所以流動(dòng)相偏堿性較合適，促使其解離，堿性物質(zhì)適合做正離子檢測(cè)，流動(dòng)相中適當(dāng)?shù)募尤胨?，促使其形成正離子，流動(dòng)相中適當(dāng)加一些醋酸鈉（或者醋酸銨），可形成加鈉的正離子或者加銨的正離子。

 

推薦使用的流動(dòng)相和添加劑:

有機(jī)溶劑: 

反相:乙腈/甲醇/乙醇/異丙醇/二氯甲烷

正相:吐侖/己烷/苯/環(huán)己烷/四氯化碳

緩沖液:  乙酸銨/甲酸銨

酸:  甲酸/乙酸/三氟乙酸(正離子)

堿:  氨水

 

不推薦使用/盡量不用的:

有機(jī)溶劑: 四氫呋喃

緩沖液: 磷酸鹽/檸檬酸鹽/碳酸鹽

酸: 硫酸/磷酸/鹽酸/高氯酸/磺酸

堿:  季胺/強(qiáng)堿/三乙胺

其他: 清潔劑/表面活性劑/離子對(duì)試劑/不揮發(fā)的鹽

 

雷區(qū)二

糖苷類的物質(zhì)在做FAB和esi（＋）時(shí)，峰往往比峰要強(qiáng)，此為經(jīng)驗(yàn)，原因只是推測(cè)可能和天然產(chǎn)物的提取過(guò)程有關(guān)；鹽類化合物如鹽酸鹽、硫酸鹽在質(zhì)譜中酸的部分一般不會(huì)出現(xiàn)；二羧酸鹽（esi負(fù)離子模式）除了分子離子峰外，會(huì)出現(xiàn)連續(xù)掉44的兩個(gè)峰，為失去羧酸根的離子，這三個(gè)峰非常特征，但是會(huì)受錐孔電壓的影響，調(diào)低電壓譜圖會(huì)更漂亮。

 

雷區(qū)三

胺類物質(zhì)做esi質(zhì)譜時(shí)要注意進(jìn)樣量要少，因?yàn)楹苋菀纂x子化，不易沖洗干凈，會(huì)影響后面樣品的測(cè)定。像三乙胺在液質(zhì)聯(lián)用時(shí)不能用于調(diào)節(jié)流動(dòng)相pH值。若不慎引入三乙胺，在正離子檢測(cè)時(shí)總會(huì)出現(xiàn)很強(qiáng)的102峰（三乙胺的）。

 

雷區(qū)四

質(zhì)譜用水一般用娃哈哈純凈水之類的就很好；質(zhì)譜用甲醇和乙腈，換用了很多品牌，發(fā)現(xiàn)Merck的還是稍微好一些；Finnigan用的氮?dú)獠灰欢ㄒ玫揭旱浚闷胀ǖ匿撈繗饩涂梢粤?，可能還省錢些；建議大家買一個(gè)好一點(diǎn)的手電筒和一個(gè)放大鏡，手電筒用來(lái)看源里面，放大鏡看你割的毛細(xì)管平整。

 

雷區(qū)五

質(zhì)譜的基線其實(shí)跟液相的紫外檢測(cè)器和熒光檢測(cè)器一樣，基線高的原因不外乎內(nèi)部和外部的原因。

1）你選擇的流動(dòng)相在質(zhì)譜的響應(yīng)比較高，比如水相比較多的時(shí)候，噪音比較大些；還有如果鹽含量比較大的時(shí)候，噪音更大些。

2）檢測(cè)器的靈敏度越高的時(shí)候，噪音應(yīng)該越高。如果質(zhì)譜的污染比較嚴(yán)重時(shí)，基線肯定比較高。比如離子阱檢測(cè)器，用得久了，阱中的離子就會(huì)增多，一方面降低了質(zhì)譜的靈敏度，另一方面增加了基線噪音。

3）質(zhì)譜的基線很多時(shí)候還跟你選擇的離子寬度有關(guān)。比如你作選擇離子掃描的時(shí)候，基線就低些。你作選擇反應(yīng)掃描的時(shí)候，離子寬度不要選得太寬，太寬噪音就高些。

4）多級(jí)質(zhì)譜一般做二級(jí)或三級(jí)質(zhì)譜，基線噪音就低很多。

 

雷區(qū)六

質(zhì)譜維護(hù)經(jīng)驗(yàn)交流：做樣前－檢查氮?dú)?，流?dòng)相，質(zhì)譜儀的真空度，毛細(xì)管溫度…

1）最好不用直接進(jìn)樣（容易污染離子源）；

2）做聯(lián)用時(shí)最好分流（a可以使用常規(guī)柱，b縮短分析時(shí)間，c延長(zhǎng)質(zhì)量分析器壽命）；

3）最好使用在線切換閥，降前每個(gè)樣品的前后1-2分鐘的流動(dòng)相切入廢液（避免樣品中的鹽進(jìn)入質(zhì)譜，做Sequence時(shí)可以把平衡柱子的流動(dòng)相切入廢液）；

4）開始聯(lián)用前，直接運(yùn)行質(zhì)譜數(shù)分鐘，可以先將溫度（毛細(xì)管溫度和離子源溫度（APCI）加熱到預(yù)設(shè)定值（如果是APCI源還可以避免將燒掉heater，太貴了，最好別燒）；

5）待機(jī)時(shí)將切換閥置于waste，避免剛開液相時(shí)將流動(dòng)相打入離子源；

6）關(guān)機(jī)前毛細(xì)管的溫度先降下來(lái)，穩(wěn)定一段時(shí)間后再關(guān)閉電源，避免風(fēng)扇停止轉(zhuǎn)動(dòng)后毛細(xì)管外圍的熱量向里擴(kuò)散，容易引起內(nèi)部線路及電子元器件老化加速；

7）每天清理毛細(xì)管口外部，擦洗干凈，每次停機(jī)時(shí)注意清洗Skimmer，用無(wú)塵擦拭紙，kimberly那種；

8）如果用的是鋼瓶而且天天做樣的話，將兩個(gè)鋼瓶并聯(lián)，當(dāng)然，一月不做一次的話就算了；

9）做定量時(shí)注意離子源噴針的具體位置，否則標(biāo)準(zhǔn)曲線就不能用了；

10）不要不經(jīng)過(guò)柱子分離進(jìn)行定量分析，結(jié)果不可靠（競(jìng)爭(zhēng)性抑制目標(biāo)分子離子化）；

11）如果是負(fù)離子檢測(cè)的話，可以相流動(dòng)相中加入少量異丙醇；

12）不要使用不揮發(fā)性鹽，如果使用揮發(fā)性鹽，但濃度不要超過(guò)20mmoL/L；

13）需要使用酸的情況下可以用甲酸，乙酸，三氟乙酸可以用，但能用甲酸或乙酸時(shí)就別用TFA；

 

雷區(qū)七

理論上液質(zhì)聯(lián)用禁止使用任何不揮發(fā)性的緩沖鹽，如果需要盡量使用諸如乙酸氨等揮發(fā)性鹽，濃度不要超過(guò)20mmoL/L。

 

對(duì)于不揮發(fā)性的緩沖鹽，如果你的儀器有吹掃捕集的話也可使用，但一定要小心。萬(wàn)不得已也不要用，首先有不揮發(fā)鹽是得不到好的離子流的，其次鹽留在質(zhì)譜中很難除掉，除非停機(jī)清洗，不然一直會(huì)影響其他樣品的分析。

 

可以找質(zhì)譜友好的條件來(lái)做液質(zhì)聯(lián)機(jī)，例如色譜條件為20mM磷酸鹽的水/乙腈流動(dòng)相，做液質(zhì)聯(lián)機(jī)的時(shí)候就可以用醋酸銨代替，然后用醋酸調(diào)節(jié)pH值與磷酸鹽的一致即可。

 

除了難揮發(fā)的鹽，三乙胺、表面活性劑、還有高濃度（>0.5%）的TFA，都對(duì)質(zhì)譜不好，液質(zhì)聯(lián)用的流動(dòng)相中應(yīng)該避免。